余 波，周思旋，谭诗文，徐景峨，史开志，杨 莉
（贵州省畜牧兽医研究所，贵阳 ５５０００５）
摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪细小病毒ＶＰ２基因序列设计特异性的引物，ＰＣＲ扩增获得猪细小病毒ＶＰ２基因片段，并克隆到ｐＭＤ－１８Ｔ载体上作为阳性标准品。通过对ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化，建立了猪细小病毒的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ诊断方法，以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现１个单特异峰，无引物二聚体，对ＰＲＶ、ＰＣＶ－２、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ均无阳性信号扩增，可重复性好，测灵敏度可达１．０×１０１拷贝／μＬ。结果表明，研制的猪细小病毒ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点，适合于猪细小病毒临床样品的检测。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：猪细小病毒；ＶＰ２基因；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量
中图分类号：Ｓ８５２．６５＋９．１文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０１－０126－０4
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０33
Developing Ａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉng ｏｆ ＰＰＶ
ＹＵ Ｂｏ，ＺＨＯＵ Ｓｉ－ｘｕａｎ，ＴＡＮ Ｓｈｉ－wｅｎ，ＸＵ Ｊｉｎｇ－ｅ，ＳＨＩ Ｋａｉ－ｚｈｉ，ＹＡＮＧ Ｌｉ
（Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００５， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Based on ｔｈｅ ＶＰ２ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＰＶ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ， ｏｎｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ＶＰ２ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＶＰ２ ｇｅｎｅ ｏｆ ＰＰＶ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＭＤ－１８Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ． Ａｆｔｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚing ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ， ａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓly ｄｅｔｅｃｔｉng ＰＰＶ． Ｔｈｅ ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｅ ｓｈｏｗｅｄ ｏｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅａｋ. Nｏ ｐｒｉｍｅｒ－ｄｉｍｅｒｓ ｐｅａｋ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ. Nｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ＰＲＶ， ＰＣＶ－２， Ｅ．ｃｏｌｉ， ＣＳＦＶ， ＰＲＲＳＶ with ｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ＰＣＲ ｋｉｔ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ to １．０×１０１ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ ＤＮＡ． It is ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｋｉｔ ｗａｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ. Iｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＰＰＶ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＰＰＶ； ＶＰ２ ｇｅｎｅ； ＳＹＢＲ gｒｅｅｎ Ｉ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ qｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
收稿日期：２０１４－０９－２９
基金项目：贵州省农业攻关项目［黔科合ＮＹ字（２０１０）３０８５］；贵州省畜禽健康养殖技术创新能力建设项目［黔科合院所创能（２０１０）４００４］
作者简介：余 波（１９８１－），男，四川邻水人，副研究员，硕士，主要从事兽医分子生物学研究，（电话）１５０８５９１６６６１（电子信箱）ｙｕｂｏｎｋｙ＠１６３．ｃｏｍ；
通信作者，谭诗文（１９５６－），男，研究员，主要从事兽医分子生物学研究，（电子信箱）ｓｗｌｅｉｄｅｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。
猪细小病毒（Ｐｏｒｅｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原体之一，可导致母猪流产、死胎，给养猪业造成了巨大的经济损失［１－３］。目前，对该病的诊断方法包括传统的病毒分离鉴定，以及血清学诊断方法，如ＥＬＩＳＡ、胶体金等。常规的ＰＣＲ主要用于病死猪组织样本的检测，然而ＰＰＶ常呈长期低剂量隐性感染，常规的ＰＣＲ不仅无法对血清样本中的病毒进行定量检测，而且扩增反应后需要电泳检测，操作繁琐。荧光定量ＰＣＲ是与常规ＰＣＲ比较，具有重复性好、灵敏度高、能够定量等优点，已经被广泛应用于多种疾病病原的检测［４，５］。本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪细小病毒ＶＰ２基因序列设计特异性的引物，利用ＰＣＲ技术扩增获得猪细小病毒ＶＰ２基因片段，并克隆到ｐＭＤ－１８Ｔ载体上作为阳性标准品。通过对ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化，研制出猪细小病毒的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ诊断试剂盒，为猪细小病毒临床样品的检测提供科学的诊断方法。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
菌株：ＰＰＶ强毒株７９０９、ＰＲＶ闽－１株、ＰＣＶ－２、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ、猪源大肠杆菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。
主要试剂及仪器：Ｇｏｌｄｖｉｅｗ、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＤＬ２０００、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）及相应１０×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ、ＤＨ５α，ｐＭＤ－１８Ｔ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ酶等购自宝生物（大连）工程有限公司；ＴＩＡＮａｍｐ病毒基因组ＤＮＡ／ＲＮＡ提取试剂盒、琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。荧光定量ＰＣＲ仪为Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｅｐ ｒｅａｌｐｌｅｘ ４ 实时荧光定量ＰＣＲ仪。
１．２ 试验方法
１．２．１ 引物设计
根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪细小病毒ＶＰ２基因序列设计１对特异性引物，上游引物：５′－ＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧ
ＴＴＡＧＡＡＴＣ－３′，下游引物：５′－ＴＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＧＴＴ－３′，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。
１．２．２ 病毒核酸的提取
１）组织样品：取待检样品淋巴结组织样品共约０．５ ｇ，加入５００ μＬ ＰＢＳ缓冲液，待检样品研磨后 －７０ ℃反复冻融３次，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心取上清液用于核酸的提取。病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ的提取参照ＴＩＡＮａｍｐ病毒基因组ＤＮＡ／ＲＮＡ提取试剂盒说明书进行，将提取的ＤＮＡ／ＲＮＡ于－７０ ℃保存。猪大肠杆菌参照细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒说明书进行，将提取的ＤＮＡ－２０ ℃保存。
２）血清样品：取５０ μＬ血清加入等体积的血清裂解缓冲液［５０ μｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０），１５０ μｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２ μｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，１％Ｔｒｉｔｏｎ×１００，５％ ＳＤＳ］，混匀后煮沸５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心取上清液２ μＬ用于荧光定量ＰＣＲ和普通ＰＣＲ。
１．２．３ ｐＭＤ－１８Ｔ－ＰＰＶ－ＶＰ２阳性标准品的制备 用“１．２．１”中的引物，对ＰＰＶ ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，反应条件为：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ １ ｍｉｎ，退火温度５５ ℃ １ ｍｉｎ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，３０个循环；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。将扩增的１０８ ｂｐ ＰＣＲ产物用琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒回收ＤＮＡ片段，与ｐＭＤ－１８T－克隆载体连接，转化感受态细胞ＤＨ５α，重组体命名为ｐＭＤ－１８Ｔ－ＰＰＶ－ＶＰ２，同时送宝生物工程（大连）有限公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒ｐＭＤ－１８Ｔ－ＰＰＶ－ＶＰ２在Ｄ２６０ ｎｍ／Ｄ２８０ ｎｍ处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行１０倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。
１．２．４ 荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化 荧光定量ＰＣＲ反应在２５ μＬ反应体系中进行，对荧光定量ＰＣＲ反应条件，包括退火温度（５０、５５、６０ ℃），引物浓度（５、１０、２０ μｍｏｌ／Ｌ），进行优化以确定最佳反应条件。上下游引物（５、１０、２０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ-Ｔａｑ １２．５ μＬ，ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ０．５ μＬ，模板１ μＬ，用超纯水补足至２５ μＬ，同时以超纯水作为空白对照。反应条件为：９４ ℃ １０ ｓ；９４ ℃ ５ ｓ，退火温度（５０ ℃、５５ ℃、６０ ℃）１０ ｓ，７２ ℃ １０ ｓ，４０个循环。
１．２．５ 荧光定量ＰＣＲ反应标准曲线的建立 用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒ｐＭＤ－１８Ｔ－ＰＰＶ－ＶＰ２，计算出重组质粒的浓度和纯度，计算ＤＮＡ拷贝数，随后将标准阳性样本进行连续１０倍系列稀释，以“１．２．４”的条件进行扩增，每个稀释倍数３个重复，以拷贝数为横坐标，以Ｃｔ值为纵坐标建立标准曲线。
１．２．６ 敏感性试验 将重组质粒ｐＭＤ－１８Ｔ－ＰＰＶ－ＶＰ２计算ＤＮＡ拷贝数后，进行１０倍比稀释后分别进行荧光定量ＰＣＲ反应，每个稀释倍数３个重复，以确定建立的荧光定量ＰＣＲ诊断的敏感性。
１．２．７ 特异性试验 以ＰＰＶ、ＰＣＶ－２、ＰＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ ｃＤＮＡ进行荧光定量ＰＣＲ反应，每个样品３个重复，以确定建立的荧光定量ＰＣＲ诊断方法的特异性。
１．２．８ 重复性试验 应用建立的荧光定量ＰＣＲ方法重复检测ＰＰＶ ＤＮＡ样品３次，以检验结果的可靠性。
１．２．９ 试剂盒的组装与保存期检测 应用建立的荧光定量ＰＣＲ组装成试剂盒。试剂盒组成：①荧光定量ＰＣＲ反应混合液；②ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ；③引物；④阴性对照；⑤阳性对照；⑥去离子水；⑦裂解液。将试剂盒各组份分别保存于室温、４ ℃和－２０ ℃，设置１周、６个月、１年3个时间梯度，对阳性菌株进行检测。
１．２．１０ 荧光定量ＰＣＲ试剂盒对临床样品的检测 对２０１２～２０１３年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪养殖场和养殖专业户采集的６９份疑似病料，１８１头份发病猪场未发病猪血清，应用研制的试剂盒进行检测，同时应用文献［６］中的方法进行普通ＰＣＲ。
２ 结果与分析
２．１ ｐＭＤ－１８Ｔ－ＰＰＶ－ＶＰ２阳性标准品的制备
用“１．２．１”中的引物，对ＰＰＶ ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，能有效扩增出了目的片段，片段大小为１０８ ｂｐ，无非特异性片段产生（图１）。将宝生物（大连）工程有限公司测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的ＰＰＶ-ＶＰ２基因序列比对，核苷酸相似度为９８．９％～１００％。
２．２ 荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化
荧光定量ＰＣＲ反应在２５ μＬ反应体系中最佳反应条件为：退火温度５５ ℃，引物浓度１０ μｍｏｌ／Ｌ，能出现最高的荧光值、最小的Ｃｔ值，且在熔解曲线分析中不出现非特异性峰。
２．３ 荧光定量ＰＣＲ反应标准曲线的建立
将标准样品１０倍倍比稀释，取１．０×１０６、１．０×１０５、１．０×１０４、１．０×１０３、１．０×１０２、１．０×１０１拷贝／μＬ ６种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量ＰＣＲ扩增反应，得到扩增反应的标准曲线（图２），线性回归方程为Ｃｔ＝－３．１４１×ｌｇ拷贝数＋２６．７（Ｒ２＝０．９９６）。
２．４ 熔解曲线分析
在ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ结束后对扩增反应进行熔解曲线分析，结果见图３。扩增产物的溶解温度Ｔｍ为７８．６～７９.0 ℃，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现。
２．５ 敏感性试验
将标准样品１０倍倍比稀释，取１．０×１０６、１．０×１０５、１．０×１０４、１．０×１０３、１．０×１０２、１．０×１０１、１．０×１００ 拷贝／μＬ ７种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量ＰＣＲ扩增。由图４可知，结果显示其灵敏度为１．０×１０１拷贝／μＬ。
２．６ 特异性试验
由图５可知，以ＰＰＶ、ＰＣＶ－２、ＰＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ ｃＤＮＡ进行荧光定量ＰＣＲ反应，以确定建立的荧光定量ＰＣＲ诊断方法的特异性，结果ＰＰＶ为阳性，而ＰＣＶ－２、ＰＲＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ、ＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ ｃＤＮＡ为阴性。
２．７ 重复性试验
应用建立的荧光定量ＰＣＲ方法重复检测ＰＰＶ ＤＮＡ样品３次，以检验结果的可靠性，结果均一致。
２．８ 试剂盒的组装与保存期检测
应用建立的荧光定量ＰＣＲ组装成试剂盒。试剂盒组成：①荧光定量ＰＣＲ反应混合液（Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ）２５０ μＬ；② ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ２０ μＬ；③引物 ４０ μＬ；④阴性对照 ２０ μＬ；⑤阳性对照 ２０ μＬ，⑥去离子水５００ μＬ；⑦裂解液 ８００ μＬ。将试剂盒保存在４ ℃、－２０ ℃分别于１个月、３个月、６个月、１年对阳性样品进行检测，４ ℃保存１年阳性拷贝数降低99%，－２０ ℃保存１个月、３个月、６个月、１年对阳性拷贝数无影响。
２．９ 试剂盒对临床样品的检测
对２０１２～２０１３年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪养殖场和养殖专业户６９份疑似病料（组织）的荧光定量ＰＣＲ阳性率为３６．２％（２５／６９），普通ＰＣＲ阳性率为３３．３％（２３／６９）。１８１头份发病猪场未发病猪血清荧光定量ＰＣＲ阳性率为１0．０％（１８／１８１），普通ＰＣＲ阳性率为０％（０／１８１）。
３ 小结与讨论
猪细小病毒ＶＰ２基因是其主要免疫原性蛋白，在决定毒株的组织嗜性和致病性上起重要作用［７－９］。王金良等［１０］应用猪细小病毒ＶＰ２全基因进行原核表达建立了间接ＥＬＩＳＡ检测方法。赵俊龙等［１１］根据猪细小病毒ＶＰ２基因，建立的猪细小病毒ＰＣＲ方法能检测出１０－４×ＴＣＩＤ５０的病毒含量。但普通ＰＣＲ检测的灵敏度相对较低，主要用于组织病料的检测，不能有效检出猪群血清中ＰＰＶ的隐形感染。李小康等［１２］建立基于ＴａｑＭａｎ探针的猪细小病毒荧光定量ＰＣＲ检测方法，该方法的敏感性为１００拷贝／μＬ，可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的ＰＰＶ，但其未对感染猪场未发病猪血清进行检测。
基于ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎⅠ的实时荧光定量ＰＣＲ技术则无需探针，且价格较ＴａｑＭａｎ探针低廉，但荧光染料能和任何双链ＤＮＡ结合。因此，它也能与非特异的双链ＤＮＡ（如引物二聚体）结合，容易产生假阳性信号，但可以通过融解曲线分析克服这一缺陷［１３］。本研究根据猪细小病毒ＶＰ２基因序列设计特异性的引物，利用ＰＣＲ技术扩增获得猪细小病毒ＶＰ２基因片段，并克隆到ｐＭＤ－１８Ｔ载体上作为阳性标准品。通过对ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ反应条件的优化，建立了猪细小病毒的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ荧光定量ＰＣＲ诊断方法，灵敏度可达１．０×１０１拷贝/μＬ，扩增产物的溶解温度Ｔｍ为７８．６～７９.0 ℃，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现，适合于临床样品的检测。
本研究中６９份疑似病死猪病料（组织）中病毒含量量较高，因此荧光定量ＰＣＲ和普通ＰＣＲ符合率为９２．０％，而发病猪场未发病猪血清ＰＰＶ病毒含量较低，普通ＰＣＲ未检测到血清中的病毒，而研制的试剂盒能检测到隐性感染的ＰＰＶ。因此，本试剂盒可应用于ＰＰＶ早期感染和隐性感染检测，有利于猪场ＰＰＶ的净化。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 殷 震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．第二版．北京：科学出版社，１９９７．
［２］ 李刚明，姜天童，方雨玲，等．猪细小病毒的分离与鉴定［Ｊ］．中国兽医科技，１９９４，２４（１０）：１９－２０．
［３］ 戎 伟，杨润德．聚合酶链式反应检测猪细小病毒方法的研究［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００４，２６（６）：４６５－４６７．
［４］ 袁亚男，刘文忠．实时荧光定量ＰＣＲ技术的类型、特点与应用［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００８，３５（３）：２７－３０．
［５］ 李 安，谢金文，魏加贵，等．荧光定量ＰＣＲ技术在分子检测上的研究进展［Ｊ］．中国畜牧兽医２００９，３６（４）：７３－７７．
［６］ 余 波，谭诗文，冉懋韬，等．检测ＰＲＶ野毒株、ＰＣＶ－２及ＰＰＶ多重ＰＣＲ方法的建立及初步应用［Ｊ］．畜牧与兽医，２０１０，４２（５）：１５－１８．
［７］ ＭＯＬＩＴＯＲ Ｔ Ｈ， ＪＯＯ Ｈ Ｓ， ＣＯＬＬＥＴＴ Ｍ Ｓ．Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ： ｖｉｒｕｓ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖｉｒｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ｖｉｍｌ，１９８３，４５：８４２－８５４．
［８］ 刘艳华，范伟兴，隋兆峰，等．猪细小病毒ＳＤ－６８株ＶＰ２基因的克隆及序列分析［Ｊ］．中国病毒学，２００４，１９（６）：５６８－５７１．
［９］ 赵俊龙，陈焕春，吕建强，等．猪细小病毒ＶＰ２基因的克隆、测序与原核表达［Ｊ］．畜牧兽医学报，２００３，３４（２）：１９５－１９８．
［１０］ 王金良，沈志强，唐 娜，等．猪细小病毒ＰＰＶ－ＳＤ１及间接ＥＬＩＳＡ株ＶＰ２全基因原核表达检测方法的建立［Ｊ］．中国兽医杂志，２００８，４４（７）：２２－２４．
［１１］ 赵俊龙，陈焕春，吕建强，等．猪细小病毒ＰＣＲ检测方法的建立与应用［Ｊ］．中国兽医学报，２００３，２３（２）：１４２－１４４．
［１２］ 李小康，崔保安，陈红英，等．实时荧光定量ＰＣＲ检测猪细小病毒［Ｊ］．中国兽医学报，２００８，２８（１０）：１１１８－１１２１．
［１３］ 沈志强，王金良，郭显坡，等．ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光定量ＰＣＲ检测猪细小病毒方法的建立及初步应用［Ｊ］．中国兽医学报，２０１１，３１（１）：１１－１５．
（责任编辑 程碧军）