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不同提取方法对北五味子多糖提取率的影响

  • 投稿石欣
  • 更新时间2015-09-22
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程振玉1,宋海燕2,杨英杰1,刘治刚1,张 硕1

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林 吉林 132022;2.吉林农业科技学院实验中心,吉林 吉林 132101)

摘要:考察了不同提取方法对北五味子[Schisandra chinensis (Turcz.) Baill]多糖提取率的影响。分别采用回流法、微波辅助法、闪式法对北五味子多糖进行提取,通过可见-分光光度法测定其含量,设计响应面试验对其最佳方法的工艺进行优化。闪式法多糖提取率高于回流法和微波辅助法,其最佳工艺为料液比1∶20(m∶V),提取时间127 s、提取电压190 V、提取温度78 ℃,在此条件下北五味子多糖的提取率达到20.97%。不同提取方法对多糖的提取率影响较大,闪式法多糖提取率高,耗费时间短,溶剂用量少。

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关键词 :北五味子[Schisandra chinensis (Turcz.) Baill];多糖;回流法;微波辅助法;闪式法

中图分类号:R284.2文献标识码:A文章编号:0439-8114(2015)01-0159-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.041

Effects of Different Extracting Methods on Extraction Rate of Polysaccharide from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill

CHENG Zhen-yu1,SONG Hai-yan2,YANG Ying-jie1,LIU Zhi-gang1,ZHANG Shuo1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,Jilin,China;

2.Laboratory Center, Jilin Agriculture Science and Technology College,Jilin 132101,Jilin,China)

Abstract: The effects of different extraction methods on the yields of polysaccharide extracted from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill were investigated. Reflux method, microwave-assisted method and smashing tissue method were used to extract Schisandra chinensis (Turcz.) Baill polysaccharides. Visible spectrophotometry was used to determine the yields of polysaccharide. Response surface methodology was used to optimize conditions of extraction. The yields of extraction obtained from smashing tissue technique was higher than that of reflux method and microwave-assisted method. The optimal conditions of extraction were the 1∶20 of solid-liquid ratio(m∶V), 127 s of extraction time, 190 V of extraction voltage and 78 ℃ of extraction temperature. Under these conditions, the yields of polysaccharide reached 20.97%. Extraction methods had great effects on yields of polysaccharide. Smashing tissue technique had the highest extraction yields with less time, energy and solvent.

Key words: Schisandra chinensis(Turcz.)Baill; polysaccharide; reflux method; microwave-assisted method; smashing tissue method

收稿日期:2014-05-29

作者简介:程振玉(1986-),男,甘肃庆阳人,助教,硕士,主要从事天然产物化学方面的研究,(电话)15843289508(电子信箱)844503608@qq.com;

通信作者,杨英杰,教授,主要从事于天然药物分析和精细有机化学品的合成,(电话)13843228673(电子信箱)yanghjm@163.com。

北五味子[Schisandra chinensis (Turcz.) Baill]是五味子科植物五味子的干燥成熟果实,主产于吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等地[1]。五味子是著名的滋补性中药,具有收敛固涩、益气生精、补肾宁心的功效[2,3]。现代药理研究表明,北五味子多糖是其主要活性成分之一,具有提高机体免疫力、保肝、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳等生理活性[4,5]。因此,研究北五味子多糖的最佳提取工艺,对新药和功能性食品的开发具有重要的学术意义和利用价值。

北五味子多糖的传统提取多采用回流法,提取时间长,通常需要数小时,且溶剂耗费量大。近年来,微波辅助法[6,7]、闪式法[8,9]等新技术已经广泛应用于天然药物的提取,这些方法具有时间短、溶剂用量小、提取率高、简单易行等特点,但鲜见关于采用闪式法提取北五味子多糖的报道,本试验采用上述3种方法同时进行研究,优选北五味子多糖的最佳提取方法及其工艺条件,为工业化生产北五味子多糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

北五味子购买于吉林省通化市,产地为长白山,经过吉林化工学院环境与生物工程学院隋新教授鉴定为北五味子[Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.]的干燥果实。所用试剂均为分析纯。所用仪器有:722型可见分光光度计(上海欣茂仪器有限公司),XH-100A型微波合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司),JHBE-50S型闪式提取器(河南金鼎科技发展有限公司),RT-08型多功能粉粹机(荣聪精密科技有限公司),RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂),SHZ-D型循环水式真空泵(河南省巩义市英峪仪器一厂)。

1.2 多糖含量的测定

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 用葡萄糖作为标准品,采用苯酚-硫酸法[6,10]绘制标准曲线。准确称量105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准样品100.00 mg,加去离子水溶解、摇匀,定容到100 mL,制成1.00 mg/mL贮备液,取出25 mL上述贮备液置于250 mL容量瓶中,制成0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

分别精确量取上述溶液5、10、15、20、25、30、35 mL,置于7个50 mL容量瓶中,加去离子水摇匀定容。分别取1 mL,置于7个25 mL的具塞比色管中,加入新制成5%的苯酚溶液1.0 mL,再迅速加入5 mL浓硫酸,充分摇匀,另取1 mL去离子水做空白对照。于25 ℃放置30 min,在490 nm处测定吸光度值,以吸光度值为纵坐标,葡萄糖质量浓度为横坐标,绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.2 多糖含量的测定 精确称量精制干燥的北五味子多糖50 mg,用去离子水溶解后定容到100 mL,制成0.50 mg/mL溶液,取出4 mL上述溶液置于25 mL容量瓶中,制成80 μg/mL的多糖贮备液,按照绘制标准曲线的方法测定吸光度值[11-13]。按以下公式计算换算因子:

f=W/CD

式中,W为多糖质量(μg);D为多糖的稀释因子;C为多糖溶液中葡萄糖的浓度(μg/mL)。测得换算因子f为1.76。根据该因子计算多糖质量。

多糖含量=多糖质量/药材质量×100%

1.3 北五味子多糖的提取

1.3.1 回流法 将北五味子粉碎,过孔径不同的筛子, 于60 ℃烘干至恒重,精确称取10.0 g,平行称量3份。根据试验设计,按照一定的料液比(m∶V,g/mL,下同)加入去离子水,在一定的温度下回流提取一段时间。提取液经4 000 r/min离心10 min,抽滤,药渣重新加入适量去离子水洗涤,重复上述提取液的离心操作2次,合并3次滤液,用旋转蒸发仪浓缩到原体积的1/5,加入无水乙醇至体积分数为80%,静置,冷冻过夜。抽滤,沉淀经无水乙醇洗涤数次,干燥,得到北五味子粗多糖。

1.3.2 微波辅助法 与“1.3.1”相同方法处理,根据试验设计,加入一定量的去离子水,在一定的温度下以一定功率的微波辐射萃取一段时间,提取液按照上述方法操作,得到北五味子粗多糖。

1.3.3 闪式法 与“1.3.1”相同方法处理,根据试验设计,按照一定的料液比加入一定温度的去离子水,在一定的电压下提取一段的时间,提取液按照上述方法操作,得到北五味子粗多糖。

1.4 闪式法提取北五味子多糖响应面优化试验设计

在上述3种方法提取北五味子多糖的单因素试验的基础上,对多糖提取率最高的闪式法进行工艺优化。根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理,对多糖提取率影响比较显著的3个因素提取温度、提取电压、提取时间用响应面试验设计法进行优化,试验因素与水平见表1。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线及回归方程见图1。由图1可知,标准曲线的线性回归方程为y=0.009 9x-0.017 9,R2=0.999 7,在10~70 μg/mL范围内葡萄糖含量与吸光度值呈良好的线性关系,可用于多糖含量的准确分析。

2.2 回流法提取北五味子多糖单因素试验结果

由图2可知,北五味子超过60目以后,药材粒径对多糖的提取率影响很小,多糖提取率没有明显变化。但目数越大,过筛难度增加,且不利于后续抽滤等操作。因此,选择60目作为粒径的最佳水平。在4 h之前,北五味子多糖提取率随着时间的延长而增加,这可能是因为细胞的破碎程度随温度升高而增加,故水溶性北五味子多糖溶出量也变大[14]。但4 h之后,提取率反而有降低的趋势,这可能是由于长时间的高温提取,造成了糖链的降解,因此选择最佳提取时间为4 h。

由图2可知,提取温度从40 ℃上升到 60 ℃,北五味子多糖提取率缓慢增加,从60 ℃到100 ℃多糖提取率急剧增加,100 ℃时该提取率超过了60 ℃的2倍,因此选择100 ℃作为最佳提取温度。当料液比由1∶10增加到1∶40时,北五味子多糖的提取率随着溶剂的增加逐渐升高,但继续增加溶剂,多糖提取率呈下降趋势,这可能是由于杂质的析出量也增多,抑制了目标成分的析出。因此选择1∶40作为料液比的最佳水平。

综合以上结果可知,回流法提取北五味子多糖的最佳工艺条件为药材粉碎过60目筛、料液比1∶40、提取温度100 ℃、提取时间4 h。

2.3 微波辅助法提取北五味子多糖单因素试验结果

由图3可以看出,粒径对北五味子多糖的提取效果影响较大,随着药材粒径的增大,多糖提取率逐渐提高,但超过80目时,多糖的提取率呈逐渐下降的趋势,因此选择80目作为药材的最佳粒径。随着料液比逐渐增大,多糖提取率明显升高,但当料液比超过1∶10时,多糖的提取率出现拐点,呈下降趋势,因此选择1∶10作为料液比的最佳值。

由图3可以看出,北五味子多糖的提取率随着温度的升高缓慢增加,温度从80 ℃到100 ℃时,北五味子多糖的提取率急剧增加,因此选择100 ℃作为最佳提取温度。随着提取时间的延长,多糖的提取率逐渐提高,但40 min后,多糖提取率趋于稳定,因此选择40 min 作为最佳提取时间。当微波功率低于700 W时,北五味子多糖提取率随着微波功率的增加逐渐升高,700 W以后呈现平稳的趋势,从节约能源和保护设备的角度出发,选择700 W作为最佳功率。

综合以上结果可知,微波辅助法提取北五味子多糖的最佳工艺条件为药材粒径80目、料液比1∶10、微波功率700 W、提取时间40 min。

2.4 闪式法提取北五味子多糖单因素试验结果

由图4可以看出,料液比由1∶5增长到1∶20时,北五味子多糖提取率明显升高。但超过1∶20以后,多糖提取率反而呈下降的趋势,这可能是因为提取溶剂过多,药材与刀头的剪切几率下降,导致活性成分不能被充分提取。因此,应该谨慎考虑闪式提取法中溶剂的量,选择1∶20作为料液比的最佳值。当温度低于80 ℃时,北五味子多糖的提取率随着温度的增加急剧升高,80 ℃以后多糖提取率没有明显变化。考虑到温度太高可能会对多糖高级结构和活性产生影响,选择70~90 ℃进一步做优化试验。

闪式提取器最核心的优势就是集粉碎、浸泡、搅拌和振动等技术优势于一体,使其活性物质的提取速度快,完成一次提取仅需要几十秒到几分钟[15]。由图4可知,提取时间达到90 s时提取率变化不明显,表明多糖已基本提取完全,因此选择90~150 s进一步进行优化。当提取电压低于160 V时,多糖的提取率随着电压的增加逐渐升高,超过160 V以后,多糖的提取率稍有降低。从保护电机的角度综合考虑,选择130~190 V电压进行优化。

2.5 闪式法提取北五味子多糖响应面结果分析

2.5.1 模型的建立及显著性检验 利用Design-Expert 8.0软件对响应面试验结果(表2)进行二次多项式逐步回归拟合,得到方程为Y=18.56-1.00A+3.38B+0.80C+0.096AB+0.067AC+0.43BC-2.08A2-0.32B2-2.72C2。

模型的可靠性可由方差分析及相关系数来考察。由表3可知,该模型的F=50.28,P<0.000 1,证明该试验所选用的二次多项模型极显著。在总的作用因素中,A、B、C、A2、C2项(P<0.01)对多糖的提取率有极显著的影响;交互项AB、AC、BC对多糖的提取效果影响不显著,表明各因子对响应值的影响不是简单的线性关系,其交互作用影响不显著,可忽略[16]。失拟项P=0.870 7>0.05,无显著性影响,说明数据中没有异常点,模型适当,不需要引入更高次数的项;回归方程的R2=98.48%,表明本试验只有1.52%的数据不能用该模型来解释,R2=98.48%与R2adj=96.52%极为相近,说明回归方程拟合度很高,该模型能很好地描述试验结果,可以用来准确分析和预测闪式法提取北五味子多糖的结果。

2.5.2 提取工艺的响应曲面分析与优化 为了更直观地表现2个因素对北五味子多糖提取率的影响,可以设其他因素水平值为0,把提取温度、提取电压、提取时间3个因素中一个因素取0水平,选择另2个因素对多糖提取率的影响进行分析,图5直观地反映了因素间的交互作用对响应值的影响。

由图5可知,本试验所探究的因素(提取电压、提取时间、提取温度)对北五味子多糖的提取率影响均极显著,表现为曲线较陡。随着提取电压、提取温度、提取时间中任何一个因素的变化,响应值变化均较大;尤其是随着提取电压的变化,多糖提取率发生明显的变化,响应值变化较大。由Design-Expert 8.0软件对试验参数进一步优化,可以得出最优条件为提取温度77.86 ℃,提取电压190 V,提取时间126.7 s,此时的北五味子多糖提取率可达21.85%。

2.6 最佳试验条件的验证

考虑到实际操作的可行性,将北五味子多糖提取的最佳工艺条件调整为提取温度78 ℃、提取电压190 V、提取时间127 s。在此条件下进行3次重复试验,多糖提取率的平均值达到20.97%,与理论预测值基本相近,说明采用响应面法优化得到的工艺参数准确可靠,具有一定的实用价值。

2.7 不同提取方法北五味子多糖提取率的比较

根据上述研究结果,在每种方法的最佳工艺下进行3次试验,取平均值作为北五味子多糖的提取率。结果表明,回流法多糖提取率(15.39%)含量最低,微波辅助法与闪式法提取率分别为17.56%、20.97%。闪式提取法多糖提取率最高,且需要时间最短(5 min内就完成提取),其消耗的时间为微波的1/8。因此,闪式提取法不仅减少了能源的消耗,且明显提高了北五味子多糖的提取率。

3 小结

闪式法作为一种新型的提取工艺,因其具有操作简单、需要时间少、提取率高等特点已经在多种植物活性成分的提取中得到了广泛应用。本试验采用这一技术实现了北五味子多糖的高效提取,在单因素试验的基础上设计响应面优化试验,确定了闪式法提取北五味子多糖的最佳工艺为料液比1∶20,提取温度78 ℃,在190 V的电压下提取127 s,提取2次。在此优化条件下,北五味子多糖的提取率达到20.97%,与回流法和微波辅助法相比,不仅提取时间大大减少,且提取率明显提高。表明闪式提取技术操作简便,溶剂用量小,提取时间短,能耗低,效率高,为工业化大量生产北五味子多糖提供了参考。

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