程振玉１，宋海燕２，杨英杰１，刘治刚１，张 硕１
（１．吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 １３２０２２；２．吉林农业科技学院实验中心，吉林 吉林 １３２１０１）
摘要：考察了不同提取方法对北五味子［Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｔｕｒｃｚ．） Ｂａｉｌｌ］多糖提取率的影响。分别采用回流法、微波辅助法、闪式法对北五味子多糖进行提取，通过可见－分光光度法测定其含量，设计响应面试验对其最佳方法的工艺进行优化。闪式法多糖提取率高于回流法和微波辅助法，其最佳工艺为料液比１∶２０（m∶V），提取时间１２７ ｓ、提取电压１９０ Ｖ、提取温度７８ ℃，在此条件下北五味子多糖的提取率达到２０．９７％。不同提取方法对多糖的提取率影响较大，闪式法多糖提取率高，耗费时间短，溶剂用量少。
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关键词 ：北五味子［Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｔｕｒｃｚ．） Ｂａｉｌｌ］；多糖；回流法；微波辅助法；闪式法
中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）01－0159-05
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０41
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒａｔｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｔｕｒｃｚ．） Ｂａｉｌｌ
ＣＨＥＮG Ｚｈｅｎ－ｙｕ１，ＳＯＮＧ Ｈａｉ－ｙａｎ２，ＹＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｊｉｅ１，ＬＩＵ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｕｏ１
（１．School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jｉｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｌｉｎ １３２０２２，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ；
２．Laboratory Center， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉｌｉｎ １３２１０１，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ extracted ｆｒｏｍ Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｔｕｒｃｚ．） Ｂａｉｌｌ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｒｅｆｌｕｘ ｍｅｔｈｏｄ， ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｍａｓｈｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ method ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｔｕｒｃｚ．） Ｂａｉｌｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ. Vｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ was used ｔｏ determine ｔｈｅ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ. Rｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ used ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ of ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄｓ of ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｓｍａｓｈｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｒｅｆｌｕｘ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ. Tｈｅ ｏｐｔｉｍal ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ of extraction ｗｅｒｅ ｔｈｅ １∶２０ ｏｆ ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ（m∶V）， １２７ ｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， １９０ Ｖ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ ａｎｄ ７８ ℃ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅａｃｈｅｄ ２０．９７％． Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ had ｇｒｅａｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ. Sｍａｓｈｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ had ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ｗｉｔｈ less ｔｉｍｅ， ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｔｕｒｃｚ．）Ｂａｉｌｌ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｒｅｆｌｕｘ method； ｍｉｃｒｏｗａｖｅ-assisted method； ｓｍａｓｈｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ method
收稿日期：２０１４－０５－２９
作者简介：程振玉（１９８６－），男，甘肃庆阳人，助教，硕士，主要从事天然产物化学方面的研究，（电话）１５８４３２８９５０８（电子信箱）８４４５０３６０８＠ｑｑ．ｃｏｍ；
通信作者，杨英杰，教授，主要从事于天然药物分析和精细有机化学品的合成，（电话）１３８４３２２８６７３（电子信箱）ｙａｎｇｈｊｍ＠１６３．ｃｏｍ。
北五味子［Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｔｕｒｃｚ．） Ｂａｉｌｌ］是五味子科植物五味子的干燥成熟果实，主产于吉林、辽宁、黑龙江、内蒙古等地［１］。五味子是著名的滋补性中药，具有收敛固涩、益气生精、补肾宁心的功效［２，３］。现代药理研究表明，北五味子多糖是其主要活性成分之一，具有提高机体免疫力、保肝、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳等生理活性［４，５］。因此，研究北五味子多糖的最佳提取工艺，对新药和功能性食品的开发具有重要的学术意义和利用价值。
北五味子多糖的传统提取多采用回流法，提取时间长，通常需要数小时，且溶剂耗费量大。近年来，微波辅助法［６，７］、闪式法［８，９］等新技术已经广泛应用于天然药物的提取，这些方法具有时间短、溶剂用量小、提取率高、简单易行等特点，但鲜见关于采用闪式法提取北五味子多糖的报道，本试验采用上述３种方法同时进行研究，优选北五味子多糖的最佳提取方法及其工艺条件，为工业化生产北五味子多糖提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料、试剂与仪器
北五味子购买于吉林省通化市，产地为长白山，经过吉林化工学院环境与生物工程学院隋新教授鉴定为北五味子［Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ （Ｔｕｒｃｚ．） Ｂａｉｌｌ．］的干燥果实。所用试剂均为分析纯。所用仪器有：７２２型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司），ＸＨ－１００Ａ型微波合成／萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司），ＪＨＢＥ－５０Ｓ型闪式提取器（河南金鼎科技发展有限公司），ＲＴ－０８型多功能粉粹机（荣聪精密科技有限公司），ＲＥ－５２Ａ型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），ＳＨＺ－Ｄ型循环水式真空泵（河南省巩义市英峪仪器一厂）。
１．２ 多糖含量的测定
１．２．１ 葡萄糖标准曲线的绘制 用葡萄糖作为标准品，采用苯酚－硫酸法［６，１０］绘制标准曲线。准确称量１０５ ℃干燥至恒重的葡萄糖标准样品１００．００ ｍｇ，加去离子水溶解、摇匀，定容到１００ ｍＬ，制成１．００ ｍｇ／ｍＬ贮备液，取出２５ ｍＬ上述贮备液置于２５０ ｍＬ容量瓶中，制成０．１ ｍｇ／ｍＬ的葡萄糖标准溶液。
分别精确量取上述溶液５、１０、１５、２０、２５、３０、３５ ｍＬ，置于７个５０ ｍＬ容量瓶中，加去离子水摇匀定容。分别取１ ｍＬ，置于７个２５ ｍＬ的具塞比色管中，加入新制成５％的苯酚溶液１．０ ｍＬ，再迅速加入５ ｍＬ浓硫酸，充分摇匀，另取１ ｍＬ去离子水做空白对照。于２５ ℃放置３０ ｍｉｎ，在４９０ ｎｍ处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。
１．２．２ 多糖含量的测定 精确称量精制干燥的北五味子多糖５０ ｍｇ，用去离子水溶解后定容到１００ ｍＬ，制成０．５０ ｍｇ／ｍＬ溶液，取出４ ｍＬ上述溶液置于２５ ｍＬ容量瓶中，制成８０ μｇ／ｍＬ的多糖贮备液，按照绘制标准曲线的方法测定吸光度值［１１－１３］。按以下公式计算换算因子：
ｆ＝Ｗ／ＣＤ
式中，Ｗ为多糖质量（μｇ）；Ｄ为多糖的稀释因子；Ｃ为多糖溶液中葡萄糖的浓度（μｇ／ｍＬ）。测得换算因子ｆ为１．７６。根据该因子计算多糖质量。
多糖含量＝多糖质量/药材质量×１００％
１．３ 北五味子多糖的提取
１．３．１ 回流法 将北五味子粉碎，过孔径不同的筛子， 于６０ ℃烘干至恒重，精确称取１０．０ ｇ，平行称量３份。根据试验设计，按照一定的料液比（ｍ∶Ｖ，ｇ／ｍＬ，下同）加入去离子水，在一定的温度下回流提取一段时间。提取液经４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，抽滤，药渣重新加入适量去离子水洗涤，重复上述提取液的离心操作２次，合并３次滤液，用旋转蒸发仪浓缩到原体积的１／５，加入无水乙醇至体积分数为８０％，静置，冷冻过夜。抽滤，沉淀经无水乙醇洗涤数次，干燥，得到北五味子粗多糖。
１．３．２ 微波辅助法 与“１．３．１”相同方法处理，根据试验设计，加入一定量的去离子水，在一定的温度下以一定功率的微波辐射萃取一段时间，提取液按照上述方法操作，得到北五味子粗多糖。
１．３．３ 闪式法 与“１．３．１”相同方法处理，根据试验设计，按照一定的料液比加入一定温度的去离子水，在一定的电压下提取一段的时间，提取液按照上述方法操作，得到北五味子粗多糖。
１．４ 闪式法提取北五味子多糖响应面优化试验设计
在上述３种方法提取北五味子多糖的单因素试验的基础上，对多糖提取率最高的闪式法进行工艺优化。根据Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ中心组合试验设计原理，对多糖提取率影响比较显著的３个因素提取温度、提取电压、提取时间用响应面试验设计法进行优化，试验因素与水平见表１。
２ 结果与分析
２．１ 葡萄糖标准曲线的绘制
葡萄糖标准曲线及回归方程见图１。由图１可知，标准曲线的线性回归方程为ｙ＝０．００９ ９ｘ－０．０１７ ９，Ｒ２＝０．９９９ ７，在１０～７０ μｇ／ｍＬ范围内葡萄糖含量与吸光度值呈良好的线性关系，可用于多糖含量的准确分析。
２．２ 回流法提取北五味子多糖单因素试验结果
由图２可知，北五味子超过６０目以后，药材粒径对多糖的提取率影响很小，多糖提取率没有明显变化。但目数越大，过筛难度增加，且不利于后续抽滤等操作。因此，选择６０目作为粒径的最佳水平。在４ ｈ之前，北五味子多糖提取率随着时间的延长而增加，这可能是因为细胞的破碎程度随温度升高而增加，故水溶性北五味子多糖溶出量也变大［１４］。但４ ｈ之后，提取率反而有降低的趋势，这可能是由于长时间的高温提取，造成了糖链的降解，因此选择最佳提取时间为４ ｈ。
由图２可知，提取温度从４０ ℃上升到 ６０ ℃，北五味子多糖提取率缓慢增加，从６０ ℃到１００ ℃多糖提取率急剧增加，１００ ℃时该提取率超过了６０ ℃的２倍，因此选择１００ ℃作为最佳提取温度。当料液比由１∶１０增加到１∶４０时，北五味子多糖的提取率随着溶剂的增加逐渐升高，但继续增加溶剂，多糖提取率呈下降趋势，这可能是由于杂质的析出量也增多，抑制了目标成分的析出。因此选择１∶４０作为料液比的最佳水平。
综合以上结果可知，回流法提取北五味子多糖的最佳工艺条件为药材粉碎过６０目筛、料液比１∶４０、提取温度１００ ℃、提取时间４ ｈ。
２．３ 微波辅助法提取北五味子多糖单因素试验结果
由图３可以看出，粒径对北五味子多糖的提取效果影响较大，随着药材粒径的增大，多糖提取率逐渐提高，但超过８０目时，多糖的提取率呈逐渐下降的趋势，因此选择８０目作为药材的最佳粒径。随着料液比逐渐增大，多糖提取率明显升高，但当料液比超过１∶１０时，多糖的提取率出现拐点，呈下降趋势，因此选择１∶１０作为料液比的最佳值。
由图３可以看出，北五味子多糖的提取率随着温度的升高缓慢增加，温度从８０ ℃到100 ℃时，北五味子多糖的提取率急剧增加，因此选择１００ ℃作为最佳提取温度。随着提取时间的延长，多糖的提取率逐渐提高，但４０ ｍｉｎ后，多糖提取率趋于稳定，因此选择４０ ｍｉｎ 作为最佳提取时间。当微波功率低于７００ Ｗ时，北五味子多糖提取率随着微波功率的增加逐渐升高，７００ Ｗ以后呈现平稳的趋势，从节约能源和保护设备的角度出发，选择７００ Ｗ作为最佳功率。
综合以上结果可知，微波辅助法提取北五味子多糖的最佳工艺条件为药材粒径８０目、料液比１∶１０、微波功率７００ Ｗ、提取时间４０ ｍｉｎ。
２．４ 闪式法提取北五味子多糖单因素试验结果
由图４可以看出，料液比由１∶5增长到１∶２０时，北五味子多糖提取率明显升高。但超过１∶２０以后，多糖提取率反而呈下降的趋势，这可能是因为提取溶剂过多，药材与刀头的剪切几率下降，导致活性成分不能被充分提取。因此，应该谨慎考虑闪式提取法中溶剂的量，选择１∶２０作为料液比的最佳值。当温度低于８０ ℃时，北五味子多糖的提取率随着温度的增加急剧升高，８０ ℃以后多糖提取率没有明显变化。考虑到温度太高可能会对多糖高级结构和活性产生影响，选择７０～９０ ℃进一步做优化试验。
闪式提取器最核心的优势就是集粉碎、浸泡、搅拌和振动等技术优势于一体，使其活性物质的提取速度快，完成一次提取仅需要几十秒到几分钟［１５］。由图４可知，提取时间达到９０ ｓ时提取率变化不明显，表明多糖已基本提取完全，因此选择９０～１５０ ｓ进一步进行优化。当提取电压低于１６０ Ｖ时，多糖的提取率随着电压的增加逐渐升高，超过１６０ Ｖ以后，多糖的提取率稍有降低。从保护电机的角度综合考虑，选择１３０～１９０ Ｖ电压进行优化。
２．５ 闪式法提取北五味子多糖响应面结果分析
２．５．１ 模型的建立及显著性检验 利用Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ ８．０软件对响应面试验结果（表２）进行二次多项式逐步回归拟合，得到方程为Ｙ＝１８．５６－１.00Ａ＋３．３８Ｂ＋０．８０Ｃ＋０．０９６ＡＢ＋０．０６７ＡＣ＋０．４３ＢＣ－２．０８Ａ２－０．３２Ｂ２－２．７２Ｃ２。
模型的可靠性可由方差分析及相关系数来考察。由表３可知，该模型的Ｆ＝５０．２８，Ｐ＜０．０００ １，证明该试验所选用的二次多项模型极显著。在总的作用因素中，Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ２、Ｃ２项（Ｐ＜０．０１）对多糖的提取率有极显著的影响；交互项ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ对多糖的提取效果影响不显著，表明各因子对响应值的影响不是简单的线性关系，其交互作用影响不显著，可忽略［１６］。失拟项P＝０．８７０ 7＞０．０５，无显著性影响，说明数据中没有异常点，模型适当，不需要引入更高次数的项；回归方程的Ｒ２＝９８．４８％，表明本试验只有１．５２％的数据不能用该模型来解释，Ｒ２＝９８．４８％与Ｒ２ａｄｊ＝９６．５２％极为相近，说明回归方程拟合度很高，该模型能很好地描述试验结果，可以用来准确分析和预测闪式法提取北五味子多糖的结果。
２．５．２ 提取工艺的响应曲面分析与优化 为了更直观地表现２个因素对北五味子多糖提取率的影响，可以设其他因素水平值为０，把提取温度、提取电压、提取时间３个因素中一个因素取０水平，选择另２个因素对多糖提取率的影响进行分析，图5直观地反映了因素间的交互作用对响应值的影响。
由图５可知，本试验所探究的因素（提取电压、提取时间、提取温度）对北五味子多糖的提取率影响均极显著，表现为曲线较陡。随着提取电压、提取温度、提取时间中任何一个因素的变化，响应值变化均较大；尤其是随着提取电压的变化，多糖提取率发生明显的变化，响应值变化较大。由Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ 8.0软件对试验参数进一步优化，可以得出最优条件为提取温度７７．８６ ℃，提取电压１９０ Ｖ，提取时间１２６．７ ｓ，此时的北五味子多糖提取率可达２１．８５％。
２．６ 最佳试验条件的验证
考虑到实际操作的可行性，将北五味子多糖提取的最佳工艺条件调整为提取温度７８ ℃、提取电压１９０ Ｖ、提取时间１２７ ｓ。在此条件下进行３次重复试验，多糖提取率的平均值达到２０．９７％，与理论预测值基本相近，说明采用响应面法优化得到的工艺参数准确可靠，具有一定的实用价值。
２．７ 不同提取方法北五味子多糖提取率的比较
根据上述研究结果，在每种方法的最佳工艺下进行３次试验，取平均值作为北五味子多糖的提取率。结果表明，回流法多糖提取率（１５．３９％）含量最低，微波辅助法与闪式法提取率分别为１７．５６％、２０．９７％。闪式提取法多糖提取率最高，且需要时间最短（５ ｍｉｎ内就完成提取），其消耗的时间为微波的１／８。因此，闪式提取法不仅减少了能源的消耗，且明显提高了北五味子多糖的提取率。
３ 小结
闪式法作为一种新型的提取工艺，因其具有操作简单、需要时间少、提取率高等特点已经在多种植物活性成分的提取中得到了广泛应用。本试验采用这一技术实现了北五味子多糖的高效提取，在单因素试验的基础上设计响应面优化试验，确定了闪式法提取北五味子多糖的最佳工艺为料液比１∶２０，提取温度７８ ℃，在１９０ Ｖ的电压下提取１２７ ｓ，提取２次。在此优化条件下，北五味子多糖的提取率达到２０．９７％，与回流法和微波辅助法相比，不仅提取时间大大减少，且提取率明显提高。表明闪式提取技术操作简便，溶剂用量小，提取时间短，能耗低，效率高，为工业化大量生产北五味子多糖提供了参考。
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