刘 念，熊燕飞，彭俊讲，许瀚之，廖立菁，蔡小雨，许 云
（武汉理工大学生物科学与技术系，武汉 ４３００７０）
摘要：水下固形物表面微生物的黏附生长是生物污损层形成和生物腐蚀的初级阶段。从长江水体分离得到三株淡水黏附菌，在前期对其形态特征进行研究的基础上，对其黏附生长进行了初步研究，探讨了壳聚糖和鱼精蛋白两种物质对它们生长、黏附的抑制作用。结果显示，３种菌株在玻璃片上能迅速黏附，壳聚糖与鱼精蛋白处理菌体后能明显改变菌株生长或黏附情况；处理材料表面后能显著改变材料表面能，引起不同的微生物黏附现象。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：淡水黏附菌；壳聚糖；鱼精蛋白；细菌生长；黏附
中图分类号：Ｏ６３６．１；Ｑ９３９．９ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）01－0027-04
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．００8
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Roles ｏｆ Ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｏｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ Ｂｉｏｃｏｅｎｏｓｉｓ
ＬＩＵ Ｎｉａｎ，ＸＩＯＮＧ Ｙａｎ－ｆｅｉ，ＰＥＮＧ Ｊｕｎ－ｊｉａｎｇ，ＸＵ Ｈａｎ－ｚｈｉ，ＬＩＡＯ Ｌｉ－ｊｉｎｇ，ＣＡＩ Ｘｉａｏ－ｙｕ，ＸＵ Ｙｕｎ
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｆｏｕｌｉｎｇ ｌａｙｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ of ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｕｎｄｅｒｗａｔｅｒ． Tｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ were isolated ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｙａｎｇｔｚｅ Ｒｉｖｅｒ． Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒs ａｎｄ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ. Tｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｏｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｗａｓ investigated． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｄｈｅｒｅｄ ｔｏ ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅ ｒａｐｉｄｌｙ. Ｃｈｉｔｏｓａｎ ａｎｄ ｐｒｏｔａｍｉｎｅ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ. Tｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｕｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ ｃａｕｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｃｈｉｔｏｓａｎ； ｐｒｏｔａｍｉｎｅ； ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ； ａｄｈｅｓｉｏｎ
收稿日期：２０１４－０４－１７
基金项目：武汉理工大学自主创新研究基金资助项目（１３６６１４００３）
作者简介：刘 念（１９９３－），男，湖北汉川人，在读本科生，研究方向为微生物学，（电话）１８０７１２８８２８７（电子信箱）１０１１０５０９７６＠ｑｑ．ｃｏｍ；
通信作者，熊燕飞，女，副教授，硕士，主要从事生物材料和酶学方面的研究，（电子信箱）１５９２６２０４２３１＠１２６．ｃｏｍ。
水下设施及船体表面形成的生物污损层［１］是由多种生物及其附属物构成的开放生态系统。研究表明，放在海水中的任何物体表面很快就被单层的有机质所覆盖，称为调节膜［２］，其后，细菌和其他微小的浮游生物，如原生动物和各种微藻及其孢子等开始黏附，这些微生物在调节膜的滋养下形成生物膜［３，４］，最先附着的微生物的生长会增加表面的粗糙度和疏水性［５］，防垢层表面的有机物又能作为微生物再生长的碳源［６］，进一步引导海绵、水螅、海藻、石灰虫以及藤壶、贝类等次级附生物附着。生物污损是不可逆的，会导致膜的损坏从而增加操作成本［７］，给航运、海防及水产养殖等行业带来巨大的经济损失和安全隐患。
壳聚糖薄膜的润湿性与膜表面的粗糙度有关，自然干燥的膜具有较大的粗糙度，稳定的具有微纳米结构的壳聚糖膜有望成为防污、防水、防雾、自清洁、无损运输等良好的膜材料［８，９］。
本试验重点研究了壳聚糖、鱼精蛋白及利用它们改性之后的材料对分离得到的三种淡水黏附菌的生长、黏附带来的影响。
１ 材料与方法
１．１ 材料
试验菌株：长江武汉市段黄鹤楼轮渡引桥水线下约２０ ｃｍ处悬片取样分离的菌株，分别记为ＡＢ－ｗ，ＡＢ－ｙ，ＡＢ－ｌｙ，作为试验菌株。
培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基，牛肉膏蛋白胨液体培养基。
主要试剂：壳聚糖，平均相对分子质量３００.00，脱乙酰度８５％（青岛海洋研究所）；硫酸鱼精蛋白，生化试剂（ＢＲ，国药集团化学试剂有限公司）；戊二醛，分析纯（ＡＲ，国药集团化学试剂有限公司）；其他常用试剂均为分析纯（ＡＲ）。
１．２ 方法
１．２．１ 试验菌株的分离培养与纯化 长江武汉市段黄鹤楼轮渡引桥水线下约２０ ｃｍ处，悬挂灭菌载玻片，分别于０．５、１ 、２ 、６、２４ ｈ取出，采用影印法，将载玻片上菌体印迹至牛肉膏蛋白胨固体平板上，３７ ℃恒温培养２４ ｈ，观察比较挂片不同时长后玻片黏附菌的数量及种类。选取优先黏附、数量较多的菌落，用平板划线法进行二次分离纯化，革兰氏染色观察。
１．２．２ 试验菌株的生长、黏附观察 将试验菌株从３７ ℃过夜活化牛肉膏蛋白胨固体斜面保种管中取两环，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，３７ ℃，１００ ｒ/ｍｉｎ空气摇床培养３ ｈ后作为菌液。
取菌液７００ μＬ加入５０ ｍＬ牛肉膏蛋白胨液体培养基中，分别添加７００ μＬ无菌去离子水、２０ ｍｇ/ｍＬ壳聚糖溶液、１０ ｍｇ/ｍＬ鱼精蛋白溶液，每瓶培养基中以铜丝笼置入两片盖玻片，３７ ℃，１００ ｒ/ｍｉｎ空气摇床培养。到预定时间后观察培养基情况后将盖玻片取出，以４ ｍＬ无菌去离子水轻轻冲洗两面后，在无菌滤纸上晾干，取未接触滤纸一面连续两次印迹于牛肉膏蛋白胨固体平板上，３７ ℃培养２４ ｈ。
１．２．３ 壳聚糖和鱼精蛋白对试验菌株的抑制生长观察 取２００ μＬ菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基表面，略微静置，分别滴加５０ μＬ １００．０、３３．３、２０．０ ｍｇ/ｍＬ壳聚糖溶液与１０．０ ｍｇ/ｍＬ鱼精蛋白溶液，３７ ℃培养２４ ｈ。
１．２．４ 壳聚糖溶液对菌株生长的影响 利用９６孔细胞培养板探究不同浓度壳聚糖溶液对菌株生长的影响。设置空白培养液组及试验菌株培养组，调节壳聚糖终浓度分别为０．０００ ０、０．０３７ ５、０．０７５ ０、０．１５０ ０、０．３００ ０、０．６００ ０ ｍｇ/ｍＬ，每个浓度４次重复，每孔溶液总量１００ μＬ。酶标仪中等强度振荡１０ ｓ后６３０ ｎｍ处测量每孔的吸光度，３７ ℃静置培养２０ ｈ后重复测量。
１．２．５ 改性材料检测及微生物黏附情况观察 盖玻片经高温蒸气灭菌，浸入１％戊二醛溶液中，６０ ℃恒温水浴１ ｈ。取出后放入１５ ｍＬ无菌去离子水中浸洗３次，无菌滤纸上晾干。分别置入现制的６ ｍｇ/ｍＬ壳聚糖溶液、２０ ｍｇ/ｍＬ鱼精蛋白溶液、无菌去离子水中，４ ℃静置８ ｈ，取出晾干，置于无菌培养皿中暂存。
将处理后的材料分为４组，一组以水在空气中测量接触角，重复测量５次，运用ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１２ａ，根据改进的Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ规则［１０］，计算材料表面能。
取两组以铜丝笼固定，于武汉市黄鹤楼轮渡引桥处水线下分别悬吊１５、３０ ｍｉｎ取出，以少量无菌去离子水冲洗表面杂质后自然干燥，其中３０ ｍｉｎ组经结晶紫简单染色后使用奥林巴斯倒置荧光显微镜观察，１５ ｍｉｎ组与剩下一组材料使用Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ－４８００场发射扫描电镜观察。
２ 结果与分析
２．１ 试验菌株分离结果
获得３种主要菌株，根据菌落颜色分别命名为ＡＢ－ｗ（Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ－ｗｈｉｔｅ），ＡＢ－ｌｙ（Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ－ｌｉｇｈｔ ｙｅｌｌｏｗ），革兰氏染色阴性；ＡＢ－ｙ（Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａ－ｙｅｌｌｏｗ），革兰氏染色阳性。
２．２ 试验菌株生长、黏附情况
３种试验菌株在添加有壳聚糖溶液（终浓度０．３０ ｍｇ/ｍＬ）的培养瓶中培养，开始时无明显异常，３７ ℃摇床培养１ ｈ后皆出现絮状沉淀，培养基明显较空白对照组清澈。而添加有鱼精蛋白溶液（终浓度０．１４ ｍｇ/ｍＬ）的培养瓶明显较空白对照组浑浊。如图１所示，ＡＢ－ｙ、ＡＢ－ｗ菌株与ＡＢ－ｌｙ菌株情况类似。前期试验结果显示３组培养瓶在添加相应溶液之前菌体数量无数量级差异，推知此现象为添加相应溶液所引起，若降低壳聚糖终浓度至０．２０ ｍｇ/ｍＬ则无明显絮状沉淀出现。
通过与对照组对比可知，在培养时间为１ ｈ时，添加壳聚糖可以部分减少ＡＢ－ｌｙ、显著抑制ＡＢ－ｙ在盖玻片上的黏附；添加鱼精蛋白可以有效减少ＡＢ－ｌｙ、明显抑制ＡＢ－ｙ在盖玻片上的黏附；而两种物质对ＡＢ－ｗ均无明显的抑制黏附作用。若缩短培养时间为１５ ｍｉｎ，两种物质对ＡＢ－ｙ的抑制黏附作用明显减弱，如图２所示。推知０．１４ ｍｇ/ｍＬ的鱼精蛋白溶液对于ＡＢ－ｌｙ、ＡＢ－ｙ的抑制黏附效果优于０．３０ ｍｇ/ｍＬ壳聚糖的效果。实验室条件下培养时间适当延长可以增强两种物质抑制ＡＢ－ｙ黏附的效果。
２．３ 抑菌圈大小
３种菌株对于两种物质的敏感性不一。其中ＡＢ－ｙ、ＡＢ－ｌｙ对于两种物质的敏感性类似，随着壳聚糖溶液浓度的降低，溶液黏度明显降低，抑菌圈增大较明显；１０．０ ｍｇ/ｍＬ的鱼精蛋白溶液可以显著抑制两种菌的生长。对于ＡＢ－ｗ，３种浓度下壳聚糖抑制效果不明显，鱼精蛋白抑制效果一般（图３）。
２．４ 低浓度壳聚糖溶液对菌株生长的影响
大幅度降低壳聚糖浓度后，３种菌株的反应不同。ＡＢ－ｙ生长未受明显影响；ＡＢ－ｌｙ在浓度为０．３００ ０ ｍｇ/ｍＬ前生长有小幅增强，０．３００ ０ ｍｇ/ｍＬ后生长受到抑制；ＡＢ－ｗ在试验浓度下都出现受抑制现象，随着浓度的升高抑制效果增强，在０．１５０ ０ ｍｇ/ｍＬ到０．３００ ０ ｍｇ/ｍＬ区间内变化显著，随后变化幅度的降低。结合抑菌圈试验推知为得到良好的抑制生长效果，ＡＢ－ｙ需要较高的壳聚糖溶液浓度，ＡＢ－ｌｙ相对较低，ＡＢ－ｗ最低。过高的壳聚糖溶液浓度因为其黏度的显著增加会明显降低抑制生长效果（图４）。
２．５ 改性材料性质及微生物黏附情况对比
盖玻片经过改性后，材料表面能发生明显变化，如表１和图５所示。从表1和图5可以看出，戊二醛处理后，材料接触角稍微变大，表面能略有降低，疏水性小幅增加；戊二醛与壳聚糖共同处理后，材料接触角明显变大，表面能显著降低，表现为疏水性；戊二醛与鱼精蛋白共同处理后，鱼精蛋白的加入使得材料接触角、表面能、疏水性都与未经处理的盖玻片类似。
如图６所示，从材料在江水中悬吊前后的扫描电镜结果可以看出，浸泡之前，在放大２０ ０００倍下空白对照可以看到明显的划痕；戊二醛处理后材料表面存在部分块状物；壳聚糖溶液处理后材料表面存在明显的膜状物，可解释为壳聚糖膜干燥过程中，随着溶剂及水分的蒸发，壳聚糖在溶液状态下较为伸展的分子链由于脱溶剂化而不断卷曲，分子链间的缠绕或结合趋于紧密。自然干燥条件下壳聚糖溶液蒸发速率较低，干燥时间长，分子链得到了充分卷曲和缠绕，因此形成膜的晶粒较粗大，使得薄膜结构粗糙［９］；鱼精蛋白溶液处理后可看到部分不规则颗粒。在江水中悬吊浸泡１５ ｍｉｎ之后，材料表面都发生了较大变化。其中以空白对照最为明显。
比较之后可以发现经过壳聚糖与鱼精蛋白处理过后的材料表面虽然有层状堆积，但层状堆积大小不一，堆积无明显规律，堆积较松散，悬吊前原有结构被层状堆积覆盖依稀可见；空白对照层状堆积明显，有一定的规律性，原有结构无法分辨；戊二醛处理组原本块状物消失，出现成片的堆积物。
从倒置荧光显微镜下观察悬吊材料可知，不同处理后微生物的黏附情况有很大不同。其中空白对照吸附有大量的细菌，细菌间无明显聚集成团现象，细菌排列有一定的规律，无其他微生物的黏附；戊二醛处理材料表面细菌数量较少，分布较散，无明显规律性，无其他微生物黏附；壳聚糖处理材料表面有多种微生物黏附，存在明显的聚集成团现象，细菌黏附相对较少；鱼精蛋白处理材料无多种微生物黏附现象，细菌黏附相对较少，部分分散，部分存在多个细菌有序排列成三叉状（图７）。推测上述现象是由于戊二醛处理后一定程度上降低了细菌对材料的黏附，有机物壳聚糖由于良好的成膜性，在材料表面形成了一层有机膜，一定程度上吸引了比细菌高等级的微生物的黏附；鱼精蛋白在材料表面分散分布，不会形成明显的有机膜，所以不像壳聚糖处理材料那样会黏附其他种类的微生物，而且由于鱼精蛋白的存在，导致部分细菌发生比较规律的聚集。猜想壳聚糖与鱼精蛋白处理后随着时间的延长，这些聚集的细菌会被剥落，从而达到抑制细菌黏附的作用。
３ 小结与讨论
１）壳聚糖与鱼精蛋白对分离得到的３种黏附菌确实有一定的抑制生长或黏附的作用，但是分离得到的３种黏附菌间对于壳聚糖及鱼精蛋白处理后的响应具有一定的区别。０．１４ ｍｇ／ｍＬ鱼精蛋白对抑制ＡＢ－ｙ与ＡＢ－ｌｙ的黏附效果较好，对ＡＢ－ｗ没有明显的抑制效果。１０．０ ｍｇ／ｍＬ鱼精蛋白对ＡＢ－ｙ与ＡＢ－ｌｙ有着相似的抑制生长作用，但是对ＡＢ－ｗ作用一般。为得到良好的抑制生长效果，ＡＢ－ｙ需要较高的壳聚糖浓度，ＡＢ－ｌｙ相对较低，ＡＢ－ｗ最低。
２）针对ＡＢ－ｙ菌株，相同浓度的壳聚糖与鱼精蛋白溶液处理下，适当延长培养时间更有利于抑制ＡＢ－ｙ在材料表面的黏附。
３）材料经过处理后有了明显的改变，壳聚糖处理的材料表现出较强的疏水性，鱼精蛋白处理的材料表现出较强的亲水性，二者都能显著改变微生物在其表面的黏附状态。
４）壳聚糖与鱼精蛋白抑制分离得到的３种黏附菌生长或黏附的最佳浓度还有待进一步确认，鱼精蛋白抑制黏附的浓度不同可能对促进细菌生长的效果不同。
５）壳聚糖与鱼精蛋白处理材料的方法、材料的耐久性以及抑制黏附的机理还需要进一步探究。这二者的共同点是带有大量的正电荷，这一点可能是抑制细菌黏附，避免生物污损的一个方法。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献
［１］ 严 涛，严文侠，董 钰，等．海南岛东部海域生物污损研究［Ｊ］．海洋与湖沼，１９９８，２９（４）：３７４－３８０．
［２］ 宋永香，王志政．海洋生物及其粘附机理——微生物、小型海藻、巨型海藻、贻贝［Ｊ］．中国胶粘剂，２００２，１１（４）：４８－５２．
［３］ 李 燕，高亚辉，李雪松，等．海洋硅藻附着研究进展［Ｊ］．生命科学，２００８，２０（５）：７６８－７７２．
［４］ 黄智慧，马爱军，汪 岷．鱼类体表黏液分泌功能与作用研究进展［Ｊ］．海洋科学，２００９，３３（１）：９０－９４．
［５］ ＰＡＳＭＯＲＥ Ｍ，ＴＯＤＤ Ｐ，ＳＭＩＴＨ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｂｉｏｆｉｌｍ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｊ Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ Ｓｃｉ，２００１，１９４（１）：１５－３２．
［６］ ＶＡＮ ＤＥＲ ＨＯＥＫ Ｊ Ｐ， ＨＯＦＭＡＮ Ｊ Ａ Ｍ Ｈ， ＢＯＮＮ Ｐ Ａ Ｃ， ｅｔ ａｌ． ＲＯ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ： Sｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｃｈｅｍｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｏｕｌｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｉｍｐａｃｔ［Ｊ］． Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ，２０００，１２７：８９-１０１．
［７］ ＳＡＡＤ Ｍ Ａ． Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ＲＯ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］． Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ， １９９２，８８（１－３）：８５-１０５．
［８］ 周娓娓，于春玲，金美花，等．壳聚糖膜的制备及其表面浸润性［Ｊ］．大连工业大学学报，２０１２（４）：２６２－２６４．
［９］ 赵宏霞，金 花，蔡继业．不同干燥条件下壳聚糖膜表面的微观结构及微观力学性能［Ｊ］．物理化学学报，２０１０，２６（３）：６４９－６５３．
［１０］ 刘永明，施建宇，鹿芹芹，等．基于杨氏方程的固体表面能计算研究进展［Ｊ］．材料导报，２０１３（１１）：１２３－１２９．
（责任编辑 昌炎新）