李 强，姜 山
（贵州师范大学生命科学学院，贵阳 ５５０００１）
摘要：运用超声波辅助提取、ＤＦＲＣ（衍生化后的还原裂解）法结合气相色谱－质谱法（ＧＣ－ＭＳ）对竹柳（Ｓａｌｉｘ ｍａｉｚｈｏｋｕｎｇｇａｒｅｎｓｉｓ Ｎ． Ｃｈａｏ）细胞壁综纤维素和木质素单体进行了测定；采用差重法和Ｋａｌｓｏｎ法结合紫外分光光度法测定了竹柳细胞壁综纤维素和木质素含量。结果表明，竹柳细胞壁综纤维素单体包括Ｄ－木糖、Ｌ－阿拉伯糖、Ｄ－半乳糖、Ｄ－葡萄糖、Ｌ－岩藻糖和Ｄ－纤维二糖，木质素主要由愈创木基（Ｇ）和紫丁香基（Ｓ）组成。竹柳细胞壁综纤维素含量为８０．１６％，木质素含量为１９．８４％。
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关键词 ：竹柳（Ｓａｌｉｘ ｍａｉｚｈｏｋｕｎｇｇａｒｅｎｓｉｓ Ｎ． Ｃｈａｏ）；综纤维素；木质素；衍生化后的还原裂解（ＤＦＲＣ）法
中图分类号：Ｓ７８１．４２文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０１－００97－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０25
Ｈｏｌｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ Ｌｉｇｎｉｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ ｏｆ Ｂａｍｂｏｏ Ｗｉｌｌｏｗ
ＬＩ Ｑｉａｎｇ，ＪＩＡＮＧ Ｓｈａｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００１， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｏｆ ｂａｍｂｏｏ ｗｉｌｌｏｗ（Ｓａｌｉｘ ｍａｉｚｈｏｋｕｎｇｇａｒｅｎｓｉｓ Ｎ． Ｃｈａｏ） ｗａｓ extracted ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ. Tｈｅ ｍｏｎｏｍｅｒ ｏｆ ｈｏｌｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｌｉｇｎｉｎ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＤＦＲＣ （Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ） ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｖｉａ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ （ＧＣ－ＭＳ）． Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｈｏｌｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｌｉｇｎｉｎ in ｃｅｌｌ ｗａｌｌ of ｂａｍｂｏｏ ｗｉｌｌｏｗ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｋｌａｓｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｈｏｌｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ in ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｏｆ ｂａｍｂｏｏ ｗｉｌｌｏｗ ｃｏｎｔａｉｎed Ｄ－Ｘｙｌｏｓｅ， Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｓｅ， Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓｅ， Ｌ－Ｆｕｃｏｓｅ ａｎｄ Ｄ－Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ． Ｔｈｅ ｌｉｇｎｉｎ ｆｒｏｍ ｂａｍｂｏｏ ｗｉｌｌｏｗ ｃｏｎｓｉｓｔed ｏｆ ｇｕａｉａｃｙｌ（Ｇ） ａｎｄ ｓｙｒｉｎｇｌ（Ｓ） ｕｎｉｔｓ． Ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｈｏｌｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ of ｂａｍｂｏｏ ｗｉｌｌｏｗ ｗａｓ ８０．１６％ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌｉｇｎｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ １９．８４％． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ will ｐｒｏｖｉｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅly ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅly ａｎａｌｙzing ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｔｉｍｂｅｒ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂａｍｂｏｏ ｗｉｌｌｏｗ（Ｓａｌｉｘ ｍａｉｚｈｏｋｕｎｇｇａｒｅｎｓｉｓ Ｎ． Ｃｈａｏ）； ｈｏｌｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ； ｌｉｇｎｉｎ； ＤＦＲＣ ｍｅｔｈｏｄ
收稿日期：２０１４－０５－１５
基金项目：国家自然科学基金项目（３０８６０１５８；３１２６０４２６）
作者简介：李 强（１９８１－），男，安徽枞阳人，在读硕士研究生，主要从事植物抗病性研究，（电话）13538771922（电子信箱）
ｕｎｓｉｎｋａｂｌｅｓｏｕｌ＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，姜 山，教授，博士，主要从事植物防卫反应研究，（电话）１３６２８５０１１７６（电子信箱）
ｋｙｏｓａｎ２００３１２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。
植物细胞壁主要由综纤维素、木质素和蛋白质组成，作为植物光合作用产物的主要贮积方式，构成了地球植物生物量的主要组成部分。纤维素是无水葡萄糖以β－１，４糖苷键组成的长链分子，半纤维素是戊糖、己糖和糖酸所组成的不均一聚糖［１］，木质素是由苯丙氨酸经脱氨茎、羟基化、甲基化和氧化还原反应，生成３种主要单体香豆醇、松柏醇和芥子醇，这些单体经氧化偶联聚合生成相应的3种木质素：对羟基苯基木质素（Ｈ）、愈创木基木质素（Ｇ）和紫丁香基木质素（Ｓ）［２］。综纤维素和木质素是组成木材的主要成分，它们的组成及含量与木材的性质以及木材的加工利用密切相关［３］。一般情况下，纤维素含量越高，则制浆率越高；而木质素交联在纤维素和半纤维之间形成致密的网状结构，是木材造纸的一大难题，木质素含量越低，制浆漂白越容易，消耗的化学药品越少［４，５］。通过基因工程方法调控木质素含量和组成类型，优化植物光合作用所生产的生物量在综纤维素和木质素之间的分配对木材的制浆性能有很大的潜在价值［６］。测定细胞壁中综纤维素和木质素单体成分及含量无疑为提升木材工业化应用提供了重要参考依据。
竹柳（Ｓａｌｉｘ ｍａｉｚｈｏｋｕｎｇｇａｒｅｎｓｉｓ Ｎ． Ｃｈａｏ）为杨柳科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）柳属（Ｓａｌｉｘ）落叶乔木，是经选优选育出的一个柳树品种，由于其同时具有染色体加倍实现的倍性优势和杂种优势，故不仅具备柳树所有优良特性，且具有生长速度快、抗逆性强、材质好等特点，因此作为工业原料林具有一定优势［７］。以往对于竹柳的研究主要集中在纤维质量及制浆性能方面，对于其细胞壁中综纤维素和木质素的单体成分及含量报道非常少。为此，采用超声波辅助提取、衍生化后的还原裂解（ＤＦＲＣ）法结合ＧＣ－ＭＳ分析了竹柳细胞壁综纤维素和木质素单体成分，同时还采用差重法和Ｋａｌｓｏｎ法结合紫外分光光度法测定了综纤维素和木质素含量对ＤＦＲＣ法结果加以验证，以期为更好地开发利用竹柳奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
试验材料为取自贵州省黔南地区的一年生竹柳。
仪器：ＱＰ２０１０ｃ型气相－质谱联用仪（Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司，数据库为ＮＩＳＴ２７、ＮＩＳＴ１４７）；ＬＸ－０２多功能粉碎机；１０１Ａ－３型电热鼓风干燥箱；ＨＨＳ型电热恒温水浴锅；分析天平（十万分之一，梅特勒－托利多仪器有限公司）；ＫＱ－５００ＤＥ型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ｎ－１００１型ＥＹＥＬＡ旋转蒸发仪；精密酸度计（上海大普仪器有限公司）。
试剂：乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸、溴乙酰、二氧六环、锌粉、胆固醇，均为市售分析纯。
１．２ 细胞壁样品提取
样品粉碎后，过６０～８０目筛，然后每克样品加４０ ｍＬ体积分数８０％的乙醇超声处理１０ ｍｉｎ，４ ０００ ｒ/ｍin离心５ ｍｉｎ，去上清，重复４次，再依次用氯仿／甲醇（２∶１，V∶V）和丙酮抽提１次，空气风干［８］。
１．３ ＤＦＲＣ法分析细胞壁样品
１．３．１ 溴乙酰衍生和细胞壁溶解反应 准确称量５０ ｍｇ（Ｗ１）细胞壁样品加到５０ ｍＬ具塞三角瓶中，加入１０ ｍＬ新鲜配制的溴乙酰溶液（溴乙酰∶乙醇=１∶４，Ｖ／Ｖ），盖上玻璃塞于５０ ℃轻轻搅拌３ ｈ，然后在５０ ℃以下负压蒸干［９］。
１．３．２ 还原断裂反应 向具塞三角瓶中加入１０ ｍＬ二氧六环／乙酸／水（５∶４∶１，Ｖ／Ｖ／Ｖ），再加入２００ ｍｇ（Ｗ２）锌粉，常温搅拌３０ ｍｉｎ，然后用砂芯漏斗过滤，滤渣于６０ ℃烘至恒重（Ｗ３），滤液全部转入预先备有１５ ｍＬ二氯甲烷和１５ ｍＬ饱和氯化铵的分液漏斗中，加入２００ μＬ内标（８０ ｍｇ胆固醇溶解于２ ｍＬ二氯甲烷），水相用３％的盐酸调到ｐＨ ３以下，充分混匀，静置分层并收集下部二氯甲烷相。另外用１５ ｍＬ二氯甲烷萃取饱和氯化铵相，重复２次，合并二氯甲烷相，低压旋转蒸干，乙酰化后上ＧＣ－ＭＳ分析［１０］。
１．３．３ 计算反应率
１．４ 竹柳细胞壁综纤维素含量测定
称取约１．５ ｇ细胞壁样品，于６０ ℃烘至恒重Ｗ4，再转入２５０ ｍＬ碘量瓶中，加入１５０ ｍＬ ２ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ，１０５ ℃保温５０ ｍｉｎ，然后用去离子水冲洗过滤至滤液ｐＨ ６．５～７．０，接下来依次用体积分数９５％的乙醇、无水乙醇、丙酮各洗涤２次，残渣转入已恒重的坩埚（Ｗ5）中，于６０ ℃干燥箱中烘至恒重（Ｗ6）。将残渣转入１５０ ｍＬ烧杯中，加入１５ ｍＬ预冷过的７２％的硫酸水解３ ｈ，然后加去离子水１３５ ｍＬ，室温过夜，残渣次日用去离子水冲洗过滤至滤液ｐＨ ６．５～７．０，滤渣转入已恒重的坩埚（Ｗ7）中，于６０ ℃干燥箱中烘至恒重（Ｗ8）。按公式（２）、（３）、（４）计算半纤维素、纤维素和综纤维素含量，平行测定样品６份，取平均值［１１，１２］。
综纤维素含量＝半纤维素含量＋纤维素含量（４）
１．５ 竹柳细胞壁木质素含量测定
准确称量１ ｇ（Ｗ9）细胞壁样品，加７２％的硫酸１５ ｍＬ，室温搅拌４ ｈ，转入１ ０００ ｍＬ圆底烧瓶中，加５６０ ｍＬ去离子水稀释硫酸浓度至３％，加热回流２ ｈ，再用砂芯漏斗过滤，收集滤液，残渣用热水洗涤至中性，转入已恒重的坩埚（Ｗ10）于１０５ ℃烘干至恒重，称量（Ｗ11）并按公式（５）计算酸不溶木质素含量，平行测定样品６份，取平均值［１２，１３］。
滤液在２０５ ｎｍ波长下测吸光度，如果吸光度大于０．７，则用３％的硫酸溶液稀释，当吸光度为０．２～０．７，按公式（６）和公式（７）计算，平行测定样品６份，取平均值。
式中，Ｂ为滤液中酸溶木质素的含量（ｇ／１ ０００ ｍＬ）；Ａ为吸光度；Ｄ为样品滤液的稀释倍数；Ｖ为滤液总体积；１１０为吸光系数［Ｌ／（ｇ·ｃｍ）］。
木质素含量＝酸不溶木质素含量＋酸溶木质素含量 （８）
２ 结果与分析
２．１ ＤＦＲＣ法分析细胞壁成分
衍生化后的还原裂解（ＤＦＲＣ）法包括两个重要步骤：①细胞壁在溴乙酰和乙酸混合溶液中溶解，②锌粉催化还原裂解，在溴乙酰中植物细胞壁被溶解，酸性环境下细胞壁多糖进一步水解［１４，１５］，结合ＧＣ－ＭＳ通过查找数据库可以确定样品ＤＦＲＣ法获得的化合物组成，进一步解析样品细胞壁成分。通过计算反应率得出，大于９５％的竹柳细胞壁参加了反应，所以试验中ＤＦＲＣ法产物包含了竹柳细胞壁的主要物质组成。
表１是竹柳细胞壁ＤＦＲＣ降解物气相色谱检测到的主要化合物保留时间、名称以及含量，除９和１０是内标胆固醇及其乙酰化产物外，１~８是竹柳细胞壁ＤＦＲＣ法检测到的主要产物：Ｄ－木糖乙酸酯、Ｌ－阿拉伯糖乙酸酯、Ｄ－半乳糖乙酸酯、愈创木基乙酸酯、Ｄ－葡萄糖乙酸酯、紫丁香基乙酸酯、Ｌ－岩藻糖乙酸酯和Ｄ－纤维二糖乙酸酯。根据构成综纤维素和木质素的单体类型可知，竹柳细胞壁综纤维素单体主要是Ｄ－木糖、Ｌ－阿拉伯糖、Ｄ－半乳糖、Ｄ－葡萄糖、Ｌ－岩藻糖和Ｄ－纤维二糖，木质素的单体主要是Ｇ型和Ｓ型，没有检测到Ｈ型单体。不计算内标的情况下，综纤维素和木质素的含量分别为80.16%和19.84%。
２．２ 竹柳细胞壁综纤维素和木质素含量分析
半纤维素是戊糖、己糖和糖酸所组成的不均一聚糖，易水解，高温下经稀酸处理几乎可以把半纤维素全部水解成可溶性糖；纤维素是β－１，４糖苷键组成的长链分子，长链分子进一步形成一种具有高度结晶区的超分子稳定结构，该结构可以被浓酸溶解，在溶解过程中导致纤维素的均相水解［１］，因此依次用盐酸、硫酸水解竹柳，准确称量水解前后的重量并计算差重可以得出半纤维素、纤维素以及综纤维素含量。采用Ｋｌａｓｏｎ法和紫外分光法分别测定酸不溶木质素和酸溶木质素含量，试验没有检测植物含有的少量矿质元素，结果见表２。从表2可知，综纤维素含量为７９．０３％，木质素含量为２０．３５％，对比ＤＦＲＣ法测定的糖类和木质素类含量，可以得出两种方法测得的结果基本一致，说明ＤＦＲＣ法检测出的竹柳细胞壁各成分含量可靠。
３ 小结
竹柳细胞壁综纤维素单体主要包括Ｄ－木糖、Ｄ－阿拉伯糖、Ｄ－半乳糖、Ｄ－葡萄糖、Ｌ－岩藻糖和Ｄ－纤维二糖，木质素单体主要为Ｇ型和Ｓ型。据文献报道，硬木Ｈ型木质素单体含量一般很少甚至没有，Ｌｕ等［9，14］在同是柳属的柳树中检测到的Ｈ型木质素单体含量相对于Ｇ型和Ｓ型也非常低（＜１％），而试验在竹柳细胞壁中没有检测到明显的Ｈ型木质素单体，原因有可能是竹柳细胞壁中Ｈ型木质素单体的含量过低，或是没有Ｈ型木质素单体的存在，这需要进一步的试验论证。同时还测得综纤维素含量为８０．１６％，木质素含量为１９．８４％。试验中采用的ＤＦＲＣ法是美国威斯康星州牧草研究中心建立的用于解析细胞壁结构的新方法，具有对试验条件要求不高、操作流程简洁和结果可靠等优点，目前国内鲜有将该方法运用于硬木细胞壁的研究。利用该方法对竹柳细胞壁综纤维素和木质素单体及含量的研究，将为竹柳在工业木材应用中的深入发展奠定一定的基础，还可为其他工业木材的定性定量分析提供借鉴。
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（责任编辑 王晓芳）