刘育辰，刘 刚，张 勇，黄仕清，徐文芬，王进喜，杜 江
（贵阳中医学院药学院，贵阳 ５５０００２）
摘要：利用显微镜和电镜观察雪里见（Ａｒｉｓａｅｍａ ｒｈｉｚｏｍ Ｃ．Ｅ．Ｃ．Ｆｉｓｃｈ）中草酸钙针晶的形态，并采用ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定草酸钙的含量。结果表明，草酸钙针晶细长，具有尖锐的针尖；草酸在０．０９９ ６４～１．９９２ ８0 ｇ／Ｌ范围内线性关系良好（ｒ＝０．９９９ ３）；平均回收率为１００．２３％，ＲＳＤ为１．５２％。草酸钙针晶显微结构与同科植物的基本相同，建立的含量测定方法操作简便，结果可靠，重复性好，可作为雪里见药材质量控制的方法。
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关键词 ：雪里见（Ａｒｉｓａｅｍａ ｒｈｉｚｏｍ Ｃ．Ｅ．Ｃ．Ｆｉｓｃｈ）；草酸钙针晶；显微结构；反相高效液相色谱法
中图分类号：Ｒ２８２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０１－００94－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０24
Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｘａｌａｔｅ Ｃｒｙｓｔａｌ
ｉｎ Ａｒｉｓａｅｍａ rｈｉｚｏｍ
ＬＩＵ Ｙｕ－ｃｈｅｎ，ＬＩＵ Ｇａｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｓｈｉ－ｑｉｎｇ，ＸＵ Ｗｅｎ－ｆｅｎ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎ－ｘｉ，ＤＵ Ｊｉａｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００２， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｏｘａｌａｔｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｉｎ Ａｒｉｓａｅｍａ ｒｈｉｚｏｍ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ under ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ. ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ was used to ｄｅｔｅｒｍｉｎe ｉｔｓ ｃｏｎｔｅｎｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｏｘａｌａｔｅｓ ｃｒｙｓｔａｌ ｗｉｔｈ ａ ｓｈａｒｐ ｔｉｐ ｗａｓ ｓｌｅｎｄｅｒ. Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｏｘａｌａｔｅ ｗａｓ ｗｉｔｈｉｎ ０．０９９６ ４～１．９９２ ８ ｇ／Ｌ， ｒ＝０．９９９ ３. Tｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ １００．２３％ and ＲＳＤ ｗａｓ １．５２％． Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｏｘａｌａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａ． ｒｈｉｚｏｍ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ａｒａｃｅａｅ was ｂａｓｉｃａｌｌｙ ｓａｍｅ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ of ｄｅｔｅｒｍｉｎing ｏｆ ｉｔｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ the ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａ． ｒｈｉｚｏｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ａｒｉｓａｅｍａ ｒｈｉｚｏｍ； ｃａｌｃｉｕｍ ｏｘａｌａｔｅ ｃｒｙｓｔａｌ； ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ； ＲＰ－ＨＰＬＣ
收稿日期：２０１４－０５－１５
基金项目：国家科技支撑计划项目“基于壮、傣、土家等民族特色病种药物的有效性评价及关键技术研究”（２０１２ＢＡ１２７Ｂ０６）
作者简介：刘育辰（１９８２－），女，吉林长春人，副教授，博士，从事中药、民族药化学成分及品质评价研究，（电话）１３１１８５０８５５６
（电子信箱）ｌｙｃ８５６４７３２＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，杜 江，教授，从事民族药研究，（电子信箱）ｄｕｊａｎｇ．ｇｚ＠１６３．ｃｏｍ。
雪里见为天南星科植物雪里见（Ａｒｉｓａｅｍａ ｒｈｉｚｏｍ Ｃ．Ｅ．Ｃ．Ｆｉｓｃｈ）的根茎，别名大半夏、麻脚狼毒、半截烂、躲雷草、避蛇参等。贵州、云南、四川等地的土家族和苗族将其作为治疗风湿麻木、跌打伤痛的要药。虽然雪里见在治疗某些顽固疾病和常见病方面具有独特疗效，但它对皮肤和黏膜具有强烈的刺激性［１］。２０１０年版《中国药典》收载的天南星科药材中，凡具有毒性或刺激性的药材都含有草酸钙针晶，而且国内也有学者对天南星科植物半夏［Ｐｉｎｅｌｌｉａ ｔｅｒｎａｔａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｂｒｅｉｔ］、虎掌南星（Ｐｉｎｅｌｌｉａ ｐｅｄａｔｉｓｅｃｔａ Ｓｃｈｏｔｔ）、天南星［Ａｒｉｓａｅｍａ ｅｒｕｂｅｒｓｃｅｎｓ（Ｗａｌｌ．） Ｓｃｈｏｔｔ］及白附子（Ｔｙｐｈｏｎｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ Ｅｎｇｌ．）进行了研究，认为刺激性成分可能是其具有特殊晶型的“毒针晶”，其“毒针晶”成分除了含有草酸钙外，还含有蛋白质和微量糖类成分［２－４］。
目前对雪里见的研究多集中在药材鉴定、化学成分、药理活性等方面［５－８］，对其毒性成分研究较少，郭坤坤等［１］在前期的研究工作中，推断雪里见对皮肤和黏膜的刺激性来自草酸钙针晶。为此，拟从观察雪里见中草酸钙针晶的形态和测定雪里见中草酸钙针晶的含量着手，通过与同科药材中草酸钙针晶形态的比较，并建立一个简便、准确测定草酸钙针晶含量的方法，以期为后续开展炮制对雪里见中草酸钙针晶形态结构、含量的影响及炮制机理研究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
药材：雪里见药材经贵阳中医学院杜江教授鉴定为天南星科植物雪里见的根茎。
试剂：草酸对照品（贵州迪大生物科技有限公司，纯度≥９８％）；磷酸二氢钾、磷酸、盐酸、冰醋酸、甘油为分析纯；水为娃哈哈纯净水。
仪器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００高效液相色谱仪（四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、ＤＡＤ检测器）；ＸＳ２０５型十万分之一分析天平（瑞士ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ）；ＨＳ１０２６０Ｄ型超声波清洗器（天津恒奥）；ＨＩ９８１０７型ｐＨ计（意大利ＨＡＮＮＡ）；爱国者数码显微镜ＥＶ５６１０；ＨＵＳ－５ＧＢ型高真空镀膜机（日本ＨＩＴＡＣＨＩ公司）、ＪＦＣ－１６００型离子溅射仪（日本ＪＥＯＬ公司）、ＪＳＭ－６４９０ＬＶ型扫描电子显微镜（日本ＪＥＯＬ公司）。
１．２ 方法
１．２．１ 草酸钙针晶形态观察
１）显微观察样品制备。将样品粉碎，用冰醋酸－甘油－水（Ｖ／Ｖ，１∶１∶１）封片，于光学显微镜下观察并拍照。
２）扫描电镜样品制备。将样品粉末用胶带粘置观测台上，于ＨＵＳ－５ＧＢ型高真空镀膜机中进行高真空镀碳膜，再于ＪＦＣ－１６００型离子溅射仪中镀铂金膜，在电流１００ ＨＡ、加速电压２０ ｋＶ的条件下扫描、观察并进行显微拍照。
１．２．２ 草酸钙含量测定
１）色谱条件及系统适应性试验。色谱柱Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流动相：０．５％KH2PO4－H3PO4水溶液（ｐＨ ２．３），流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长２１０ ｎｍ，柱温２２ ℃，进样量１０ μＬ。
２）草酸对照品溶液的配制。称取草酸对照品适量，精密称定，加去离子水配制成１．９９２ ８0 ｇ／ｍＬ的草酸溶液，作为对照品储备液。
３）供试品溶液的制备。取雪里见粉末０．４ ｇ置于离心管中，加入去离子水３ ｍＬ，混匀，超声处理１０ ｍｉｎ，置７０ ℃水浴锅中加热，并搅拌１０ ｍｉｎ，４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取上清液，残渣以热去离子水洗涤３次，每次２ ｍＬ，混匀，离心，合并上清液，然后加盐酸（体积比１∶１）溶液０．４ ｍＬ，去离子水３ ｍＬ，混匀，方法同上，分离沉淀与上清液，沉淀用０．１ ｍｏｌ／Ｌ的HCl同上法处理２次，每次２ ｍＬ，离心，合并上清液定容至１０ ｍＬ量瓶中，备用［９］。
１．２．３ 标准曲线的绘制 精密吸取草酸对照品溶液适量，依次用去离子水稀释成０．０９９ ６４、０．１９９ ２８、０．４９８ ２０、０．７９７ ２０、０．９９６ ４０、１．９９２ ８０ ｇ／Ｌ的对照品溶液，用０．４５ μｍ微孔滤膜滤过，取续滤液１０ μＬ注入液相色谱仪。以对照品进样浓度（ｇ／Ｌ）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程
。结果表明草酸在０．０９９ ６４～１．９９２ ８０ ｇ／Ｌ范围内线性关系良好。
２ 结果与分析
２．１ 草酸钙针晶形态观察结果
从图１和图２可以看出，雪里见的草酸钙针晶细长，具有尖锐的针尖，多是单个散在，很少成束，长短不一，晶体有的表面光滑，有的具有小的突起，有的表面还具有凹槽。
２．２ 草酸钙含量测定结果
２．２．１ 对照及样品色谱图 对照及样品色谱图见图３。
２．２．２ 精密度试验 精密吸取草酸对照品溶液（浓度０．４９８ ２０ ｇ／Ｌ）１０ μＬ，重复进样６次，测定草酸峰面积，计算并折算成样品中草酸钙含量，其ＲＳＤ为０．７６％，表明仪器精密度良好。
２．２．３ 重复性试验 取同一批号样品，平行制备供试品溶液６份，分别进样１０ μＬ，测定草酸峰面积，计算并折算成样品中草酸钙含量，其ＲＳＤ为１．１８％，表明试验的重复性良好。
２．２．４ 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液１０ μＬ，分别于０、２、４、６、８、１２ ｈ进样，测定草酸峰面积，计算并折算成样品中草酸钙含量，其ＲＳＤ为０．１５％，表明供试品溶液在１２ ｈ内稳定性良好。
２．２．５ 准确度 采用加样回收法。精密称取已测定含量的雪里见样品粉末６份各约０．２ ｇ，分别加入草酸对照品适量，按“１．２．２”的制备方法及色谱条件测定，计算并折算成样品中草酸钙含量，计算加样回收率和ＲＳＤ值，结果见表１。结果表明试验准确度良好。
２．２．６ 样品含量测定 取样品制备供试品溶液，RP-ＨＰＬＣ测定，计算并折算成样品中草酸钙含量，具体见表２。
３ 小结与讨论
３．１ 雪里见中草酸钙的显微形态
从雪里见草酸钙针晶的电镜扫描图可以看出，与同科的半夏、虎掌南星、天南星及禹白附药材的针晶形态相似［４］，针晶都是极为细长，具有尖锐的针尖，但其表面有的比较光滑，有的具有小的突起，有的还具有凹槽，其具体原因有待进一步研究。有文献报道，粉碎粒度对草酸钙针晶的形态、数量和存在的方式有所改变［１０］，因此建议考察粉碎粒度对雪里见中草酸钙形态的影响。由于雪里见有毒，一般需要炮制后使用，建议考察不同炮制方法对其草酸钙形态的影响。
３．２ 雪里见中草酸钙的含量测定
草酸钙针晶不溶于水及有机溶剂，因此对样品进行简单处理，先将可溶性的草酸盐去除，然后再通过酸处理使草酸钙转化为草酸，再采用ＲＰ－ＨＰＬＣ法测定草酸的含量并换算成药材中所含有的不溶性草酸钙针晶的含量［２，３，５］。
分别对流动相组成、流动相ｐＨ、流速、柱温、检测波长进行了考察，结果表明，以０．５％ ＫＨ２ＰＯ４－Ｈ３ＰＯ４水溶液作为流动相且ｐＨ为２．３时，流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温２２ ℃，检测波长２１０ ｎｍ时色谱峰信号强，且分离度良好，基线平稳。
虽然天南星科药材中都含有草酸钙针晶，但含量差别很大，半夏、水半夏、白附子、天南星中草酸钙的含量分别为１．２２２ ８％、１．１４７ ２％、０．６６８ ５％、０．６８８ ６％［１１］，而雪里见中草酸钙针晶的含量都在２％以上，天南星科药材中草酸钙针晶的含量与其毒性是否存在相关性还有待进一步研究。试验采用RP-ＨＰＬＣ法测定雪里见中草酸钙针晶含量，该方法简便、易行、快速，结果准确可靠，可作为雪里见药材质量控制的方法。同时该方法为后期比较雪里见药材炮制前后草酸钙针晶含量影响及机理研究打下了基础。
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参考文献：
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［４］ 吴 皓，葛秀允，郁红礼，等．天南星科４种有毒中药针晶的晶型结构和其毒性的比较［Ｊ］．中国中药杂志，２０１０，３５（９）：１１５２－１１５５．
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（责任编辑 王晓芳）