贺 丹１，毛仓仓１，陈 颖２，王 政１，何松林１
（１．河南农业大学林学院，郑州 ４５０００２；２．郑州市经纬广场，郑州 ４５００００）
摘要：以凤丹白牡丹（Ｐａｅｏｎｉａ ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ Ａｎｄｒ．）继代愈伤组织为材料，研究不同外源Ｈ２Ｏ２浓度下牡丹愈伤组织生长过程中过氧化物酶（ＰＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性的变化，探究酶活性变化与牡丹愈伤组织生长、分化的关系。结果表明，在愈伤组织生长过程中，当Ｈ２Ｏ２浓度达到５０ μｍｏｌ／Ｌ以上时，愈伤组织形态均出现了不同程度的变化；100 μmol/L H2O2处理的ＳＯＤ活性在第５天达到峰值，与其他处理呈显著差异，之后逐渐下降；ＰＯＤ和ＣＡＴ活性变化基本一致，在第５天出现明显上升，之后下降，然后趋于平稳。从形态观察和３种抗氧化酶活性结果来看，１００ μｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２对牡丹胚性愈伤组织的形成和体细胞胚的诱导有促进作用。
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关键词 ：外源Ｈ２Ｏ２；牡丹（Ｐａｅｏｎｉａ ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ Ａｎｄｒ．）；愈伤组织分化；抗氧化酶活性
中图分类号：Ｓ６８５．１１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）01－0122-04
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０１．０32
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ ｏｎ Ｃａｌｌｕｓ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｏｎｙ
ＨＥ Ｄａｎ１，ＭＡＯ Ｃａｎｇ－ｃａｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｙｉｎｇ２，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ１，ＨＥ Ｓｏｎｇ－ｌｉｎ１
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ；２． Ｊｉｎｇｗｅｉ Ｓｑｕａｒｅ of Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ City，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： “Ｆｅｎｇｄａｎｂａｉ” ｐｅｏｎｙ （Ｐａｅｏｎｉａ ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ Ａｎｄｒ．） was used to study， ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＰＯＤ， ＣＡＴ ａｎｄ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｅｏｎｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｃｅｓｓ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｈ２Ｏ２. Tｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ of ｅｎｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ was investigated． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｇｒｏｗｔｈ， ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｆｏｒｍｓ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ２Ｏ２ was ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ５０ μｍｏｌ／Ｌ． Ｔｈｅ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ 100 μmol/L H2O2 ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｉｎ ｔｈｅ ５ｔｈ ｄａｙ with ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ from ｏｔｈｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ， ｔｈｅｎ ｄｅｃｌｉｎｅｄ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈis ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ＰＯＤ ａｎｄ ＣＡＴ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｂａｓｉｃａｌｌｙ same． It ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｌｉｎｅｄ， ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ ｔｅｎｄｅｄ ｔｏ be stable． Tｈｅ １００ μｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ of ｐｅｏｎｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｈ２Ｏ２； ｐｅｏｎｙ （Ｐａｅｏｎｉａ ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ Ａｎｄｒ．）； ｃａｌｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ
收稿日期：２０１４－０９－２９
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１４００５７）；郑州市科技创新团队计划项目（１０ＣＸＴＤ１４７）
作者简介：贺 丹（１９８３－），女，河南新乡人，讲师，主要从事园林植物栽培生理研究，（电话）18203608867（电子信箱）ｄａｎｄａｎ９９０１１１＠１６３．ｃｏｍ；
通信作者，何松林（１９６５－），男，河南淮阳人，教授，博士生导师，主要从事园林植物栽培生理研究，（电子信箱）ｈｓｌ２１３＠１６３．ｃｏｍ。
牡丹（Ｐａｅｏｎｉａ ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ Ａｎｄｒ．）别名木芍药、富贵花，为芍药科芍药属宿根木本花卉［１］。目前，生产上仍以播种、分株、嫁接等传统方法进行繁殖，其结实率低，无性繁殖速度慢等问题限制了品种选育工作的开展。组织培养技术为缩短牡丹的繁育周期提供了可能，但还没有形成较完善的技术体系［２］。牡丹愈伤组织分化困难一直是制约再生体系建立的瓶颈［３］，通过直接途径获得了少量的牡丹体细胞胚［４，５］。通过间接途径即体细胞诱导成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织再发育成体胚，诱导产生牡丹体胚尚未见报道。
过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）是活性氧的重要代表之一，激素等信号以及生物、非生物胁迫刺激均可诱导植物细胞内Ｈ２Ｏ２的产生和积累。近年来，有学者认为Ｈ２Ｏ２可能是一种细胞信号传导物质，有可能通过细胞的信号传递系统影响基因的调控表达，从而诱导胚性细胞的形成［６，７］。从本质上讲，胚性愈伤组织的形成过程也就是愈伤组织的分化过程，这一过程的核心是基因的差别表达。有研究表明，在枸杞体细胞胚发生过程中，一定浓度的外源Ｈ２Ｏ２可提高愈伤组织中体细胞胚的发生频率，对细胞分化及体细胞胚发生有促进作用［７］。过氧化物酶（ＰＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）等酶活性的变化与愈伤组织的生长及分化过程密切相关。有研究表明，在枸杞的体细胞胚发生过程中，３种酶相互配合来调节胚性细胞的分化与发育，且在胚胎发生与发育过程中具有特异性变化［７］；在大蒜体细胞胚胎发生过程中，这３种酶活性的变化与胚性愈伤组织的诱导及体胚的发育密切相关［８］；ＰＯＤ在石刁柏和小麦的体细胞胚胎发生、发育的各个时期，其活性均高于对照［９，１０］。本研究以凤丹白牡丹的继代愈伤组织为材料，尝试利用外源Ｈ２Ｏ２诱导牡丹胚性愈伤组织，研究诱导过程中ＰＯＤ、ＣＡＴ和ＳＯＤ活性的变化，探究酶活性变化与愈伤组织生长、分化的关系，旨在为牡丹体细胞胚的发生提供研究基础。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
２０１２年２月采集凤丹白牡丹鳞芽，采集地点为洛阳市土桥花木种苗有限公司牡丹苗木基地。将鳞芽灭菌后接种到ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋７ ｇ／Ｌ琼脂＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖（ｐＨ ５．８）的固体培养基上，培养３０ ｄ后获得牡丹试管苗。然后将试管苗的叶柄在无菌条件下转入ＭＳ＋ １．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋ １．０ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ ＋７ ｇ／Ｌ琼脂＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖（ｐＨ ５．８）的固体培养基上，培养４０ ｄ后获得愈伤组织。愈伤组织在无菌条件下再转入ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋ １．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋７ ｇ／Ｌ琼脂＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖（ｐＨ ５．８）的固体培养基上，进行增殖培养，获得继代愈伤组织。以上培养条件均为温度（２４±１） ℃，光照度４０ μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ），光照时间１２ ｈ／ｄ。
１．２ 试验方法
将获得的凤丹白继代愈伤组织转入添加有４种不同浓度Ｈ２Ｏ２（处理Ⅰ ５０ μｍｏｌ／Ｌ、处理Ⅱ １００ μｍｏｌ／Ｌ、处理Ⅲ ２００ μｍｏｌ／Ｌ、处理Ⅳ ３００ μｍｏｌ／Ｌ）的ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋７ ｇ／Ｌ琼脂＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖（ｐＨ ５．８）的固体培养基上进行培养，每处理接种２０瓶。
１．３ 测定方法
供试材料转入含有不同浓度Ｈ２Ｏ２的培养基后，分别于０、５、１０、１５、２０、２５ ｄ进行随机取样。准确称取材料０．２ ｇ，加２ ｍＬ磷酸缓冲液（５０ ｍｍｏ１／Ｌ，含１％ＰＶＰ及０．２ ｍｍｏ１／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ ７．８）及少量石英砂，于冰浴中研磨，匀浆液于４ ℃，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，上清液用于酶活性的测定，３次重复。
ＰＯＤ、ＣＡＴ活性测定参照李合生［１１］的方法，略加改动。ＳＯＤ活性测定参照赵世杰［１２］的方法。
１．４ 数据统计与分析
试验数据采用邓肯氏新复极差法（ＳＳＲ法）检测其差异显著性，采用Ｅｘｃｅｌ软件和ＤＰＳ软件３．０１版对数据进行统计处理。
２ 结果与分析
２．１ Ｈ２Ｏ２对牡丹愈伤组织生长分化的影响
供试材料转入含有不同浓度Ｈ２Ｏ２的培养基后，经过２５ ｄ的培养后，观察牡丹愈伤组织的生长变化，结果如图１所示。从图１中可以看出，在不同浓度Ｈ２Ｏ２处理条件下，牡丹愈伤组织的生长呈不同的变化。处理Ⅰ的愈伤组织呈绿色至黄绿色，形态较致密；处理Ⅱ出现了一定程度的褐化，愈伤组织表面及边缘出现较多类似球形胚的凸起，与周围愈伤组织易于剥离；处理Ⅲ与处理Ⅳ愈伤组织表面出现少量凸起，多呈黄绿色至白色，处理Ⅳ的褐化情况较严重，接种的２０瓶中均有不同程度的污染。
２．２ 牡丹愈伤组织生长过程中ＰＯＤ活性的变化
如图２所示，牡丹愈伤组织转入含有不同浓度Ｈ２Ｏ２的培养基后，４个处理愈伤组织的ＰＯＤ活性整体呈上升－下降－平稳的趋势。其中０～５ ｄ，除处理Ⅲ外，其他处理的ＰＯＤ活性均大幅上升；５～１０ ｄ，处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的ＰＯＤ活性急速下降，处理Ⅲ愈伤组织的ＰＯＤ活性呈缓慢下降的趋势，并于第１０天出现最低值１３２．７５ U／（ｇ·ｍｉｎ）；１０～１５ ｄ，处理Ⅰ愈伤组织的ＰＯＤ活性平缓下降，处理Ⅱ、Ⅳ愈伤组织的ＰＯＤ活性继续大幅下降，而处理Ⅲ的ＰＯＤ活性则缓慢上升；１５～２５ ｄ，处理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ愈伤组织的ＰＯＤ活性则保持缓慢上升的趋势，第２５天分别达到２７９．９４、３０９．３８、３０８．０６ U／（ｇ·ｍｉｎ）。从ＰＯＤ活性的整体变化来看，除处理Ⅲ外，其他处理在５ ｄ前后出现了剧烈变化，１５ ｄ后变化趋于平缓。
２．３ 牡丹愈伤组织生长过程中ＳＯＤ活性的变化
如图３所示，将牡丹愈伤组织转入含有不同浓度Ｈ２Ｏ２的培养基后，４个处理的ＳＯＤ活性整体变化趋势较为平缓。其中０～５ ｄ，４个处理的ＳＯＤ活性均有上升，处理Ⅱ的变化最大，达到了３８２．５６ U／（ｇ·ｍｉｎ）；５～１０ ｄ，处理Ⅱ的ＳＯＤ活性有小幅下降，并于第１０天出现较低值３１７．６９ U／（ｇ·ｍｉｎ），而处理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的ＳＯＤ活性均呈上升趋势；１０～１５ ｄ， ４个处理的ＳＯＤ活性均缓慢上升，且于第１５天分别达到３４２．５８、３４０．７１、３４８．２１、３４７．４４ U／（ｇ·ｍｉｎ）；之后，４个处理的ＳＯＤ活性呈下降趋势，第２５天分别降至２１９．７２、１７７．３３、２０１．６１、２９１．６２ U／（ｇ·ｍｉｎ）。从ＳＯＤ的活性变化来看，处理Ⅱ的ＳＯＤ活性在第５天达到了峰值，并与其他处理显著差异。
２．４ 牡丹愈伤组织生长过程中ＣＡＴ活性变化
如图４所示，将牡丹愈伤组织转入含有不同浓度Ｈ２Ｏ２的培养基后，０～５ ｄ，４个处理的ＣＡＴ活性均呈上升趋势；５～１０ ｄ时，又迅速下降；１０～１５ ｄ，处理Ⅰ、Ⅱ的ＣＡＴ活性持续下降，并于第１５天降至最低值２３７．５、１８７．５ U／（ｇ·ｍｉｎ），而处理Ⅳ的ＣＡＴ活性则又出现上升；１５～２０ ｄ，处理Ⅲ的ＣＡＴ活性继续下降并于第２０天出现最低值１８７．５ U／（ｇ·ｍｉｎ）；２０～２５ ｄ，处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的ＣＡＴ活性保持快速上升趋势，处理Ⅳ的ＣＡＴ活性则缓慢下降。
３ 小结与讨论
本试验研究Ｈ２Ｏ２对牡丹体细胞胚诱导的作用，通过对愈伤组织生长形态的观察及抗氧化酶（ＰＯＤ、ＳＯＤ、ＣＡＴ）活性的测定，初步发现一定浓度的Ｈ２Ｏ２对诱导牡丹体细胞胚形成起促进作用。这３种酶与胚性愈伤组织的诱导有密切关系，它们相互配合调节胚性愈伤组织的生长与分化［８］。
崔凯荣等［７］、邢更妹等［１3］认为当继代愈伤组织转入分化培养基后，ＳＯＤ活性呈上升趋势，直到多细胞原胚期，ＳＯＤ活性达到最高峰，表明ＳＯＤ活性升高对胚性细胞的分化以及早期胚胎发育有促进作用。本试验中第５天，除处理Ⅱ的ＳＯＤ活性达到峰值，之后下降，而其他处理的变化趋势较为平缓，因此在本试验中处理５ ｄ可能是胚性细胞分化的时期。崔凯荣等［7］以枸杞为材料进行研究，结果表明转入分化培养基的继代愈伤组织只有在ＳＯＤ活性升高时才会发生细胞分化，同时认为细胞的分化取决于ＳＯＤ与Ｈ２Ｏ２的相互作用。另外，很多研究表明，胚性愈伤组织中ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴ的活性均较高［１５］，说明胚性愈伤组织细胞的适应性、抗逆性强于非胚性愈伤组织，能够为胚性细胞分化、体胚的产生创造有利的条件［16，17］。ＰＯＤ与ＣＡＴ是与清除Ｈ２Ｏ２相关的酶类［１8］，本试验中当Ｈ２Ｏ２浓度为１００ μｍｏｌ／Ｌ时，两者的变化基本一致，这与枸杞［７］、木薯［19］的体胚发生过程中ＰＯＤ、ＣＡＴ活性变化趋势相一致。而詹园凤等［８］在研究大蒜体细胞胚发生过程中发现，ＰＯＤ活性的变化趋势与ＳＯＤ和ＣＡＴ活性的变化趋势相反，这可能是不同作物体胚发生过程中抗氧化系统的协调方式不同所致。
在体细胞胚的诱导及发生时间方面，不同物种的差异不大。枸杞在由继代愈伤组织转入分化培养基后，经３ ｄ培养即开始有胚性细胞形成，１５ ｄ左右时即形成大量球形胚［７］。樱桃番茄在转入分化培养基后，１４ ｄ球形胚开始形成，经历心形胚、鱼雷胚后３５ ｄ开始形成子叶胚［20］。石刁柏在培养１个月后，可以在培养物中挑选出愈伤组织、球形胚、梨形胚、成熟胚等［21］。本试验的形态观察和３种抗氧化酶活性的结果表明，１００ μｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２对牡丹胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导有促进作用，后期应在培养方式、培养时间等方面进一步深入研究，以获得理想的结果。
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（责任编辑 赵 娟）