陆铮铮１，蒋选利２
（１．遵义师范学院生命科学学院，贵州 遵义 ５６３００２；
２．贵州大学农学院/贵州省山地农业病虫害综合防治重点实验室，贵阳 ５５００２５）
摘要：从健康烟草根围土壤中分离、筛选得到对烟草青枯病菌拮抗效果较好的放线菌和细菌。经鉴定两株拮抗放线菌均属链霉菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），分别是绿色类群橄榄绿链霉菌（Ｓ． ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ）、粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（Ｓ． ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ）；拮抗细菌分别为蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、球形赖氨酸芽孢杆菌（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕ）。在贵州省麻江县烟田进行田间试验，３次平均相对防效从大到小依次为粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（６３．６５％）、球形赖氨酸芽孢杆菌（６０．０３％）、蜡样芽孢杆菌（４３．８５％）、绿色类群橄榄绿链霉菌（４１．７６％）、４０％硫酸链霉素（１７．１１％）。
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关键词 ：烟草青枯病；放线菌；细菌；田间试验
中图分类号：Ｓ４３５.７２ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）01－0087-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.022
Ｆｉｅｌｄ Tｅｓｔ ｏｆ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ sｏｌａｎｃｅａｒｕｍ
ＬＵ Ｚｈｅｎｇ－ｚｈｅｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｘｕａｎ－ｌｉ２
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ；
２． Agriculture College/Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍａｉｎｔａｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｗｏ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ aｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ａｎｄ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ bａｃｔｅｒｉａ ｉｎｃｌｕｄing Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ， Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ａｎｄ Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕ were isolated ｆｒｏｍ ｓｏｉｌｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｔｏｂａｃｃｏ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ. Tｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｆｉｅｌｄｓ ｏｆ Ｍａｊｉａｎｇ， Ｃｏｕｎｔｙ Ｇｕｉｚｈｏｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ were selected ｔｏ ｔｅｓｔ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ Ｓｏｌａｎｃｅａｒｕｍ. Tｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ４ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ was in the order of ６３．６５％＞６０．０３％＞４３．８５％＞４１．７６％．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： tｏｂａｃｃｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ； actinomycete； bacteria； fｉｅｌｄ testing
收稿日期：２０１３－１０－２３
基金项目：中国烟草总公司贵州省公司科技项目（２００９１７）；铜仁地区烟草公司项目［贵铜烟（２００９）１０］
作者简介：陆铮铮（１９８６－），女，广西来宾人，助教，硕士，主要从事植物病害生物防治研究，（电话）１８２７５５３７７００（电子信箱）ｌｕｚｈｅｎｇ＿ｚｈｅｎｇ＠１２６．ｃｏｍ；
通信作者，蒋选利，教授，博士生导师，主要从事分子植物病理学研究，（电子信箱）ｊｘｌ３２３７＠１６３．ｃｏｍ。
由青枯劳尔氏菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ Ｅ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ）引起的烟草青枯病，又称烟瘟、“半边疯”，素有植物“癌症”之称［１］。该病菌可以侵染５０多个科的２００多种植物［２］，传播速度快，存活时间长［３］，造成的危害严重，给许多农作物带来了巨大的伤害。目前对烟草青枯病的防治尚未有理想的药剂，且抗病品种的应用也常受到自然条件的限制和抗性丧失等问题的困扰［４］。Ｃｏｏｋ等［５］和Ｃｈｅｆ［６］通过向土壤施加拮抗微生物来防治土传病害，并取得了一定的防治效果。研究者认为生物防治在未来农业生产中具有重要地位。
前期研究分离了烟草根围土壤中的微生物，通过平板对峙法筛选出了２株拮抗放线菌（平均抑菌圈直径分别为４３．２０ ｍｍ、５４．６６ ｍｍ）和２株拮抗细菌（平均抑菌圈直径分别为３９．９８ ｍｍ、４８．８８ ｍｍ）。２０１１年４月，选择在贵州麻江杏山镇麒麟村烟田中进行田间效果试验，通过采用浸根、灌根的处理方法和３次病害调查的平均结果对田间效果进行了评价。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１供试放线菌和细菌 选择抑制效果最好的２株放线菌，分别为绿色类群橄榄绿链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ，编号为Ｆ４－３）、粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（Ｓ． ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ，编号为Ｆ６－３），用燕麦液体培养基培养，制成放线菌悬浮液。选择抑制效果最好的２株细菌，分别为蜡样芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ，编号为Ｃ３－５）、球形赖氨酸芽孢杆菌（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕ，编号为Ｃ５－３），用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养，制成细菌悬浮液。
１．１．２ 培养基［７］ 液体燕麦培养基：燕麦片 ３０ ｇ、水 １ ０００ ｍＬ；固体燕麦培养基：在液体燕麦培养基中加琼脂 ２０～２５ ｇ；液体牛肉膏蛋白胨培养基（ＮＡ）：牛肉膏 ３～５ ｇ、蛋白胨 １０ ｇ、ＮａＣｌ ５ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ；固体牛肉膏蛋白胨培养基：在液体牛肉膏蛋白胨培养基中加琼脂 ２０～２５ ｇ。
１．１．３ 试区概况及供试品种 试验在麻江县杏山镇麒麟村烟田中进行，海拔９３０ ｍ，常年连作烟草，烟草青枯病发生严重，供试烟草品种为南江３号（中感青枯病）。
１．２ 方法
１．２．１ 供试菌液制备方法 用灭菌竹签挑取放线菌在固体燕麦培养基上扩大培养，于２８ ℃培养箱培养７ ｄ后，用直径为５ ｍｍ的打孔器打取放线菌的菌碟，取５个菌碟置于装有３００ ｍＬ液体燕麦培养基的５００ ｍＬ三角瓶中，于２８ ℃恒温摇床振荡培养４ ｄ可获得放线菌悬浮液。
用接种环挑取细菌于５ ｍＬ的无菌水中，混匀。用移液枪吸取０．１ ｍＬ菌液分散地放于ＮＡ平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，约２０ ｍｉｎ后，倒置于３２ ℃培养箱培养３ ｄ后，用直径为５ ｍｍ的打孔器打取细菌的菌碟，取５个菌碟置于装有３００ ｍＬ ＮＡ液体培养基的５００ ｍＬ三角瓶中，于３２ ℃恒温摇床振荡培养４ ｄ后即可获得细菌悬浮液。
１．２．２ 田间设置 试验共设６个处理，处理一：含Ｆ４－３；处理二：含Ｆ６－３；处理三：含Ｃ３－５；处理四：含Ｃ５－３；处理五：４０％硫酸链霉素（２ ０００倍稀释液，药剂对照）；处理六：清水（空白对照）。每处理３个重复，共计１８个小区，随机区组排列。每小区种有烟株８２穴，每个小区之间和田边都留出一行做为保护行。
２０１１年４月３０日移栽烟苗，移栽前先用拮抗放线菌或细菌的液体培养液浸根４０ ｍｉｎ后再移栽，移栽完毕后，每株烟苗再用生防菌悬浮液４０ ｍＬ＋清水１６０ ｍＬ混合液浇根。之后每隔２０ ｄ浇灌１次，每株烟苗使用４０ ｍＬ生防菌悬浮液浇灌，整个烟株生长期共浇灌３次。药剂对照和空白对照的浸根、灌根时间、次数相同。于２０１１年６月３０日处理完毕。
１．２．３ 田间病害调查 以整株为单位，于２０１１年６月２０日进行第一次调查，整个试验阶段共调查３次，间隔时间１０ ｄ。病害分级标准依据全国烟草行业烟草病害调查分级标准ＹＣ／Ｔ３９－１９９６进行［８］。０级：全株无病；１级：茎部偶有退绿条斑，或（和）半数以下叶片或顶叶轻度凋萎；２级：茎部有明显黑色条斑但尚未达到植株顶部，或（和）病侧半数以上叶片或部分腰叶以上叶片凋萎；３级：茎部黑色条斑达到植株顶部，或病侧叶片全部凋萎，或全株大部分叶片凋萎；４级：病株枯死。
１．２．４ 数据统计、分析方法［９］
发病率＝（发病株数／调查总株数）×１００％
病情指数＝∑（各级病株或叶数×该病级值）/（调查总株或叶数×最高级值）×１００
相对防效＝（对照区病情指数－处理区病情指数）／对照区病情指数×１００％
采用Ｅｘｃｅｌ软件计算发病率、病情指数、相对防效；ＤＰＳ数据处理系统分析平均相对防效之间的显著性差异。
２ 结果与分析
２．１ 拮抗放线菌、细菌田间试验结果
第一次调查的时间为烟苗移栽后的５０ ｄ，之后每隔１０ ｄ调查一次，共调查３次。将这３次对烟草青枯病害调查的数据单独统计，计算出３个重复小区的平均发病率、病情指数和相对防效。不同处理对烟草青枯病菌的防治效果见表１。由表１可知，①从２株放线菌的防治效果上看，与清水以及处理五相比，都表现为不同程度的防治作用。３次调查的结果都表明处理二的发病率始终是最低、病情指数最小、相对防效是最好的。②从２株细菌的防治效果上看，与清水以及处理五相比，也都表现为不同程度的防治作用。同样３次调查的结果都表明处理四的发病率始终是最低、病情指数最小、相对防效是最好的。③从２株拮抗放线菌与２株拮抗细菌的防效对比上看，处理二的效果最好。则３次调查的相对防效平均值由大到小依次为处理二（６３．６５％）、处理四（６０．０３％）、处理三（４３．８５％）、处理一（４１．７６％）、处理五（１７．１１％）。④从处理五与清水处理对比上看，施用处理五的烟株，对烟草青枯病的防治略微有效，但是防效不明显。⑤从不经过任何处理的对照组的数据上分析，其发病率随时间推移越来越大，到了后期高达６３．３８％，这说明了该地块的烟草青枯病发病非常的严重，损失相当的大。
２．２ 相对防效的差异显著性分析
由表２可知，试验的４株生防菌中对烟草青枯病的防效与处理五相比均有极显著差异。处理二与处理四３次调查表明没有显著或极显著差异，但处理二的防效略高于处理四；处理一在第一次调查时防效极显著高于处理三，但是另外两次调查防效均没有显著差异。由此可知，防治效果由高到低依次是处理二 、处理四 、处理三、处理一、处理五。
综上所述，２株拮抗放线菌和２株拮抗细菌的田间防治效果由大到小依次为Ｆ６－３、Ｃ５－３、Ｃ３－５、 Ｆ４－３。
３ 小结与讨论
１）采用平板对峙法筛选出的2株拮抗放线菌和2株拮抗细菌，不仅平板上的抑制效果明显，且田间中的防治效果也显著。其相对防效均明显好于硫酸链霉素，且效果较稳定。由此可见，烟草根围土壤中的拮抗放线菌和拮抗细菌能够较好地与病原菌竞争，从而达到防治病害发生的作用。特别是土壤中的链霉菌属和芽孢杆菌属的菌株。
２）田间试验效果表明，粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（Ｓ． ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ，编号为Ｆ６－３）的防效最好。２株拮抗细菌也表现出较好的防治效果，且细菌的繁殖速度快，培养周期短。
３）本研究是对拮抗菌悬浮液的原液进行了田间测定，还需在不同的浓度梯度上进行试验，进一步筛选出最佳的浓度，为提高这４种生防菌的利用价值提供出参考。
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参考文献：
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（责任编辑 童志婷）