杨 扬１，２，胡雪媛１，王晓林１，薛健飞１，钟方丽１
（１．吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 １３２０２２； 2.吉林大学化学学院，长春 １３００１２）
摘要：对山刺玫（Ｒｏｓａ ｄａｖｕｒｉｃａ Ｐａｌｌ．）果总黄酮的大孔树脂纯化工艺进行了优化研究，以比吸附量和比解吸量为考察指标，进行了Ｄ－１０１大孔树脂纯化工艺的优化。结果表明，其最佳工艺条件为生药浓度０．０２５ ｇ／ｍＬ；最佳上样量为０．２３ ｇ／ｇ（生药量／树脂量）；最佳吸附时间为３０ ｍｉｎ；上柱液ｐＨ为２．０～４．０；吸附速率为１ ＢＶ／ｈ；洗脱液为３ ＢＶ ７０％乙醇，洗脱流速为１ ＢＶ／ｈ。在此最佳条件下得到的山刺玫果提取物总黄酮含量由２０％提高到８５％左右。采用Ｄ－１０１型大孔树脂纯化山刺玫果总黄酮的效果较好，且操作简单，为山刺玫果的综合利用提供了依据。
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关键词 ：山刺玫（Ｒｏｓａ ｄａｖｕｒｉｃａ Ｐａｌｌ．）；果实；Ｄ－１０１型大孔树脂；总黄酮；纯化
中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０４１２－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０３９
山刺玫果又名野蔷薇果，系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫（Ｒｏｓａ ｄａｖｕｒｉｃａ Ｐａｌｌ．）的成熟果实，是一种食药同源、经济价值极高的野生果类［１，２］，广泛分布在我国东北、华北、西北等地。山刺玫全身是宝，《中药大辞典》谓其果实有健脾理气、养血调经的作用，且酸甜可食，可治消化不良、食欲不振，民间大量采食或用于泡酒、泡茶等［３，４］，山刺玫果的活性成分主要有三萜类化合物、黄酮、多种维生素、微量元素及人体必需的氨基酸等［５］。山刺玫花大而美丽，为优美的绿化观赏和绿篱树种。山刺玫根有止咳祛痰、 抗菌止痢及止血功能。黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、保肝、扩冠、消除体内自由基、抗衰老、增强人体免疫力等多种生理活性，还可以降低血液黏度，加快血液循环，临床上用于脑血栓、脑动脉硬化的治疗，具有高效、低毒副作用的优势［６－９］。
大孔吸附树脂是一类具有多孔立体结构的非离子型人工合成的有机高分子聚合物吸附剂，具有化学稳定性高、再生处理简单、选择性好、吸附速率快、吸附容量大、比表面积大、节省费用等诸多优点，被广泛用于天然产物的分离和纯化［１０－１２］。本试验使用Ｄ－１０１型大孔吸附树脂对山刺玫果总黄酮进行纯化，并优化了Ｄ－１０１型大孔吸附树脂纯化山刺玫果总黄酮的工艺条件，为更有效地利用山刺玫果，发挥其最大经济效益提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 植物材料 山刺玫果采自吉林市丰满区白山乡，经吉林化工学院药学系薛健飞博士鉴定为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫的成熟果实。
１．１．２ 试剂 芦丁标准品，中国食品药品检定研究院（批号：１００８００－２００７０７）；Ｄ－１０１型大孔吸附树脂，西安蓝晓科技有限公司；硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；水为去离子水。
１．１．３ 仪器 ＴＵ－１８１０型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；ＪＹ２００２型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；ＲＥ－５２ＡＡ型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；ＳＨＺ－Ｄ型循环水式真空泵，河南省巩义市英峪仪器厂；ＣＳ１０１－ＡＢ型电热鼓风干燥箱，中国重庆实验设备厂。
１．２ 试验方法
１．２．１ 标准曲线的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁标准品１０．０ ｍｇ于５０ ｍＬ容量瓶中，加６０％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为０．２０ ｍｇ／ｍＬ的芦丁标准品溶液，分别吸取０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０ ｍＬ溶液于２５ ｍＬ容量瓶中，在３０ ℃水浴下，加５％ ＮａＮＯ２溶液 １．０ ｍＬ，摇匀，放置６ ｍｉｎ，加１０％ Ａｌ（ＮＯ３）３溶液 １．０ ｍＬ，摇匀，放置６ ｍｉｎ，加４％ ＮａＯＨ １０．０ ｍＬ，再加６０ ％乙醇定容至刻度，摇匀，放置１５ ｍｉｎ。以相应的试剂为空白，按照分光光度法，在５０５ ｎｍ处测定其吸光度Ａ，以吸收度Ａ为纵坐标，芦丁标准品浓度Ｃ（ｍｇ/ｍＬ）为横坐标，绘制标准曲线［１３，１４］，进行直线回归，回归方程：Ａ＝１１．８６８Ｃ＋０．００３ ５，Ｒ＝０．９９９ ７，结果表明，芦丁在０．００４～０．０４８ ｍｇ／ｍＬ范围内呈良好线性关系。
１．２．２ 样品溶液的制备 取粉碎的山刺玫果２５ ｇ，加６倍７５％乙醇，８５ ℃回流提取３次，每次５ ｈ，过滤，合并滤液，减压浓缩，用去离子水定容至２５０ ｍＬ，备用。
１．２．３ 总黄酮含量测定 取样品溶液、树脂吸附后液和解吸液各适量，分别置于１０ ｍＬ容量瓶中，以不加供试品的平行样为空白。按“１．２．１”的方法，于５０５ ｎｍ处测定吸光度，根据标准曲线计算出样品中总黄酮的含量。
１．２．４ 树脂的预处理 取Ｄ－１０１树脂加入烧杯中，先以９５％乙醇浸泡２４ ｈ后湿法上柱，用醇洗至流出液加水不混浊为止，后用去离子水冲洗至无醇味；然后用２ ＢＶ ２％ ＮａＯＨ溶液以２ ＢＶ/ｈ的流速洗涤１ ｈ，用去离子水洗至中性；再用１ ＢＶ ５％ＨＣｌ溶液以４～６ ＢＶ/ｈ的流速洗涤，用去离子水洗至中性，减压抽滤干，放入广口瓶中贴签备用［１５］。
２ 结果与分析
２．１ Ｄ－１０１型树脂纯化工艺优化
２．１．１ 泄漏曲线 取处理好的Ｄ－１０１型大孔树脂１５ ｇ，湿法装柱，取生药浓度为０．０２５ ｇ/ｍＬ山刺玫果上样液２７０ ｍＬ，缓慢上柱，以３ ＢＶ/ｈ流速进行动态吸附，收集流出液，计算总黄酮浓度，泄漏曲线见图１。由图１可知，其泄漏点在第９个点附近，由此确定上样量为０．２３ ｇ/ｇ（生药量/树脂量）。
２．１．２ 上柱液浓度 吸取样品溶液适量，分别稀释２、３、４、５、６倍，将上述样品液加入５根１５ ｇ Ｄ－１０１树脂柱上，静止３０ ｍｉｎ，以３ ＢＶ/ｈ的流速进行吸附，收集过柱液，再以７０％乙醇６０ ｍＬ以２ ＢＶ/ｈ的流速洗脱，收集洗脱液，测定溶液中总黄酮浓度（Ｃ１为过柱液总黄酮浓度、Ｃ２为解吸液总黄酮浓度），计算比吸附量（ｍｇ/ｇ）、比解吸量（ｍｇ/ｇ），结果见表１ ，计算公式如下：
从解吸率和比解吸量等综合考虑，将上样浓度确定为原液稀释３倍，即生药浓度０．０２５ ｇ/ｍＬ。
２．１．３ 吸附时间 取生药浓度为０．０２５ ｇ/ｍＬ山刺玫果上样液１４０ ｍＬ，分别加入４根１５ ｇ Ｄ－１０１树脂柱上，以３ ＢＶ／ｈ的流速分别吸附１５、３０、６０、９０ ｍｉｎ，分别收集过柱液，再以７０％乙醇各６０ ｍＬ以２ ＢＶ／ｈ的流速洗脱，收集洗脱液，结果见表２。通过比吸附量的比较，３０ ｍｉｎ时吸附效果最佳，因此，确定吸附时间为３０ ｍｉｎ。
２．１．４ 吸附流速 按“２．１．３”项确定的方法取样上柱后，分别以１、２、３、４、５ ＢV/ｈ的流速吸附３０ ｍｉｎ，吸附完全后，分别收集过柱液，按“２．１．３”项确定方法洗脱，试验结果见表３。由比吸附量结果可知，吸附流速可确定为１ ＢＶ/ｈ。
２．１．５ 上柱液ｐＨ 按“２．１．３”项确定方法取样，分别调ｐＨ为２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０，加入７根１５ ｇ Ｄ－１０１树脂柱上，以１ ＢＶ/ｈ流速吸附３０ ｍｉｎ，按“２．１．３”项确定方法洗脱，结果见图２。从图２中可看出，随上样液ｐＨ的增大，吸附率逐渐下降，ｐＨ在２．０～４．０吸附率比较高，所以将上柱液ｐＨ确定为在２．０～４．０。
２．１．６ 洗脱溶媒 按“２．１．３”项确定方法取样，加于３根１５ ｇ Ｄ－１０１树脂柱上，按“２．１．３”项确定方法吸附，再分别用５０％、７０％、９０％乙醇各６０ ｍＬ以２ ＢＶ／ｈ的流速洗脱，结果见表４。通过比解吸量的比较，乙醇体积分数确定为７０％。
２．１．７ 水洗体积 按“２．１．３”项确定方法取样，上柱吸附，然后分别用１、２、３、４、５ ＢＶ去离子水洗脱，再按“２．１．６”项确定方法醇洗脱，将各洗脱液减压蒸发，浓缩干燥至恒重后称重，计算干浸膏中总黄酮含量，如表５。根据干浸膏中总黄酮的含量测定结果，确定用３ ＢＶ去离子水洗脱。
２．１．８ 洗脱流速 按“２．１．３”项确定方法取样，上柱吸附，３ ＢＶ去离子水洗脱，再分别用７０％乙醇各６０ ｍＬ以１、２、３、４、５ ＢＶ／ｈ的流速洗脱，将各解吸液减压蒸发，浓缩干燥至恒重后称重，计算干膏中总黄酮含量，结果见表６。根据干浸膏中总黄酮的含量测定结果，洗脱流速确定为１ ＢＶ/ｈ。
２．１．９ 洗脱体积 按“２．１．３”项确定方法取样，上柱吸附，３ ＢＶ去离子水洗脱，再用７０％乙醇６０ ｍＬ以１ ＢＶ／ｈ的流速洗脱，按０．５个树脂床体积（即１０ ｍＬ）收集洗脱液，共收集１６个流份，测定收集溶液中总黄酮质量，以洗脱液中总黄酮质量为纵坐标，流份收集编号为横坐标作图（图３）。从图３中可以看出，第６个流份以后溶液中总黄酮量基本不变，故用３ ＢＶ（６０ ｍＬ）７０％乙醇即可洗脱完全。
２．２ 工艺验证性试验
取已处理好的Ｄ－１０１型吸附树脂３份，各１５ ｇ，湿法装柱，分别加入生药浓度为０．０２５ ｇ/ｍＬ的山刺玫果样品液各１４０ ｍＬ，以１ ＢＶ/ｈ的流速进行吸附，３ ＢＶ去离子水洗脱，然后用６０ ｍＬ７０％乙醇以１ ＢＶ／ｈ的流速进行洗脱，收集洗脱液，再取样品液、洗脱液减压蒸发，浓缩干燥至恒重后称重，经Ｄ－１０１大孔吸附树脂处理山刺玫果总黄酮样品溶液后，干浸膏中总黄酮含量由２０％左右提高到８５％左右。
２．３ 树脂的重复使用试验
取已处理好的Ｄ－１０１型吸附树脂３份，各１５ ｇ，湿法装柱，按“２．２”项确定的方法，取样上柱吸附，水洗，醇洗，收集洗脱液，按“２．２”项下制备干浸膏并测定干浸膏中总黄酮的含量，在试验条件确定后，Ｄ－１０１型大孔吸附树脂重复使用６次后，比吸附量、比解吸量变化均较小，干浸膏中总黄酮含量随重复次数的增加有所降低，在树脂柱使用６次后总黄酮含量由８４．６０％下降到７４．１９％。
３ 结论
本试验通过对Ｄ－１０１型大孔吸附树脂对山刺玫果总黄酮纯化试验的研究，通过对影响大孔吸附树脂吸附及解吸各种因素的系统研究，筛选出了Ｄ－１０ｌ型大孔吸附树脂纯化山刺玫果总黄酮的最佳工艺条件为上柱药液浓度为０．０２５ ｇ/ｍＬ，药液ｐＨ为２．０～４．０，吸附时间３０ ｍｉｎ，吸附速率为１ ＢＶ/ｈ，吸附后用３ ＢＶ去离子水洗脱，再用３ ＢＶ 的７０％乙醇以１ ＢＶ/ｈ的流速洗脱，纯化后山刺玫果干浸膏中总黄酮含量由原来的２０％提高到８５％左右，树脂可以重复使用６次，表明Ｄ－１０1型大孔树脂对山刺玫果总黄酮具有较好的纯化性能，Ｄ－１０１大孔吸附树脂纯化山刺玫果总黄酮的工艺不仅具有比吸附量、比解吸量高等特点，而且具有洗脱率较高、树脂再生简便等优点，在含有山刺玫果总黄酮的产品分析和生产中具有一定的推广应用价值，为山刺玫果总黄酮在食品、药品领域的综合应用提供了依据。
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（责任编辑 龙小玲）