刘冰冰，李 颖，樊佳祺，王国夫，孙小红
（绍兴文理学院元培学院，浙江 绍兴 ３１２０００）
摘要：以乙醇作为提取剂制备香榧（Ｔｏｒｒｅｙａ ｇｒａｎｄｉｓ Ｍｅｒｒｉｌｌｉ）假种皮醇提物，并研究醇提物乳油制剂制备工艺。采用生长速率法测定醇提物及其乳油对黄瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、水稻稻瘟病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）、玉米小斑病菌（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｍａｙｄｉｓ）、黄瓜霜霉病菌（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）和番茄早疫病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）５种植物源病原菌的抑菌效果。结果表明，香榧假种皮醇提物对番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌等５种植物源病原菌具有较强的抑菌效果，１０ ｍｇ／ｍＬ时对５种病菌的抑制率都在４０％以上；筛选出乳油的最佳配方为香榧假种皮醇提物１４％、乳化剂（吐温－２０）１５％、溶剂（乙酸乙酯）７１％，乳油对５种病菌的抑制率都在５０％以上。可见香榧假种皮醇提物抑菌谱较广，值得进一步研究开发。
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关键词 ：香榧（Ｔｏｒｒｅｙａ ｇｒａｎｄｉｓ Ｍｅｒｒｉｌｌｉ）假种皮；乙醇提取物；乳油制剂；抑菌活性；植物病原菌
中图分类号：Ｓ４８２．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０３４９－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０２３
香榧（Ｔｏｒｒｅｙａ ｇｒａｎｄｉｓ Ｍｅｒｒｉｌｌｉ）为红豆杉科（紫杉科，Ｔａｘａｃｅａｅ）榧属（Ｔｏｒｒｅｙａ）常绿乔木，系裸子植物，是第三纪孑遗植物，又称细榧、木皮子、羊角榧等，为稀有坚果类树种，其果实香榧果具有食用和药用价值［１，２］。香榧果实一直备受青睐和肯定，但约占其种子鲜重５０％～６０％的假种皮部分则没有得到有效利用，长期被当作加工废弃物，不仅浪费资源，而且污染环境。
香榧假种皮富含多种活性物质，如黄酮类、二萜类、木脂素类化合物，还有醇、醛、烯、酚等植物芳香物质，某些物质还具有很强的抑菌活性，如木脂素类化合物、烯类化合物等。胡刘岩等［３］研究发现香榧壳挥发油含有大量的柠檬烯、蒎烯等具有抑菌作用的活性成分，这可能是其具有抑菌生物活性的原因。然而关于香榧假种皮提取物抑菌活性的研究报道较为鲜见。
植物病害是农业生产的大敌，而目前防治植物病害的主要手段为施用化学杀菌剂。由于化学农药有潜在危害，研制开发与推广应用安全、高效的生物农药已成为现代农药的主流。从植物中寻找抗菌活性物质是目前开发无公害农药的重要途径之一。本研究在测定香榧假种皮乙醇提取物抗菌活性的基础上，尝试将其制备成环保型乳油，旨在为创制和发展新型植物源农药提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
１．１．１ 植物样品 香榧假种皮收集自浙江省绍兴市稽东镇香榧基地，经绍兴文理学院元培学院金自学教授鉴定为Ｔｏｒｒｅｙａ ｇｒａｎｄｉｓ Ｍｅｒｒｉｌｌｉ 的假种皮，置于阴凉通风处自然阴干。
１．１．２ 供试菌种 黄瓜枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、水稻稻瘟病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）、玉米小斑病菌（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｍａｙｄｉｓ）、黄瓜霜霉病菌（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）和番茄早疫病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）由山东省农业科学院提供。
１．２ 测定方法
１．２．１ 醇提物制备 将香榧假种皮用中药粉碎机粉碎，取２００ ｇ粉碎物于２ ０００ ｍＬ圆底烧瓶加７０％乙醇１ ０００ ｍＬ回流提取２ ｈ，过滤，取滤液旋转浓缩成浸膏，制成香榧假种皮醇提物，密封后于０～４ ℃冰箱中保存备用。
１．２．２ 醇提物抑菌活性测定 采用菌丝生长速率法进行测定［４，５］。将香榧醇提物浸膏用少量二甲基亚砜溶解，用无菌水定容，配制成各浓度供试药液。在无菌条件下，将供试菌种用７ ｍｍ的打孔器打出一定数量的菌饼备用。熔化ＰＤＡ培养基，用移液枪移取０．５ ｍＬ药液放入培养皿内，趁热倒入１４．５ ｍＬ培养基于培养皿中制成厚薄均匀的平板，使培养基的药液最终浓度为２、４、６、８、１０ ｍｇ／ｍＬ，以添加含有同样浓度的二甲基亚砜的无菌水为对照。每培养皿放置１个菌饼，菌丝面向下，重复３次，（２８±１） ℃培养，７２ ｈ后用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率，评判醇提物抑菌活性。
菌落直径＝菌落测量直径－菌饼直径；菌丝生长抑制率＝（对照菌落直径－处理菌落直径）／对照菌落直径×１００％。
１．２．３ 醇提物乳油配方确定
１）溶剂筛选。为保证剂型环保，在乳油溶剂筛选中，弃用三苯类、芳烃类及氯仿等有毒溶剂，选择毒性相对较低的有机溶剂。取约１０ ｍｇ的香榧假种皮醇提物浸膏，点于凹形载玻片的凹面内，再用移液枪吸取５０ μＬ的溶剂点于浸膏的一侧，加盖玻片，观察扩散速度；室温静置１ ｈ后，观察溶解情况。若没有完全溶解，再滴加１０ μＬ溶剂，再观察，可逐次滴加溶剂，直至完全溶解。用２０倍体视显微镜加以确认。为防止溶剂挥发，可用凡士林密封盖玻片。所用溶剂有丙酮、乙酸乙酯、无水乙醇、甲醇等。根据浸膏在溶剂中的扩散速度和溶解度，初步筛选出较佳溶剂。试验过程中，注意避免空气流动。
２）乳化剂筛选。弃用农乳系列，选择毒性相对较低的乳化剂。以醇提物浸膏２８０ ｍｇ，以溶剂筛选确定的溶剂２ ｍＬ为基础，进行乳化剂筛选。观察所配制剂的外观，以能形成均相透明、乳化性能好的乳化剂入选。
３）乳油稳定性检测。在２５０ ｍＬ烧杯中，加入１０ ｍＬ （３０±２） ℃标准硬水（氯化钙０．３０４ ｇ、六水氯化镁０．１３９ ｇ，以蒸馏水定容至１ ０００ ｍＬ）。用移液管吸取适量乳油试样，在不断搅拌的情况下慢慢加入硬水中，配成１００ ｍＬ乳状液。２～３ ｒ／ｓ搅拌３０ ｓ，将乳状液移到清洁、干燥的１００ ｍＬ量筒中，（３０±２） ℃恒温静置水浴１ ｈ，观察乳状液分离情况。量筒中无浮油（膏）、沉油和沉淀析出，则判定乳油稳定性合格［４］。
４）乳油分散性检测。将装有５００ ｍＬ标准硬水的大烧杯置于２５ ℃的恒温水浴中，温度平衡后用移液管吸取ｌ ｍＬ乳油，离液面１ ｃｍ滴下，观察分散性。如能迅速地自动分散，水体变为乳白色透明状，则认为其扩散完全，判定乳油分散性合格。
１．２．４ 乳油抑菌活性测定 按最佳配方配制香榧假种皮醇提物乳油，测定其对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用［６］，测定方法同“１．２．２”。
２ 结果与分析
２．１ 醇提物对植物病原菌的抑制作用
不同浓度的香榧假种皮醇提物对５种供试植物病原真菌菌丝生长均有一定程度的抑制作用（表１），说明其抗菌谱较广。其中对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制效果最佳，抑制率均在６２％以上，在醇提物浓度为１０ ｍｇ／ｍＬ时抑制率最大，为７９．５７％。对水稻稻瘟病菌和黄瓜霜霉病菌菌丝生长最大抑制效果相近，其中，对水稻稻瘟病菌菌丝生长抑制效果随醇提物浓度增加而明显增加，在最大浓度１０ ｍｇ／ｍＬ时，抑制效果最佳，抑制率为６８．９７％；对黄瓜霜霉病菌菌丝生长抑制效果随醇提物浓度增加变化不明显。对玉米小斑病菌，在１０ ｍｇ／ｍＬ和６ ｍｇ／ｍＬ时的抑制率分别为５６．０８％和５３．８３％，２ ｍｇ／ｍＬ时抑制率在５０％以下；对于番茄早疫病菌，抑制率均在５０％以下，抑菌效果较差。
２．２ 醇提物乳油配方筛选结果
香榧假种皮醇提物在各溶剂中扩散速度从快到慢依次为乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、无水甲醇，溶解度分别为０．１４ ｍｇ／μＬ（乙酸乙酯）、０．１１ ｍｇ／μＬ（丙酮）、０．０７ ｍｇ／μＬ（无水乙醇），０．０６ ｍｇ／μＬ（无水甲醇），筛选得到的最佳溶剂为乙酸乙酯。以乙酸乙酯为溶剂进行乳化剂筛选（表２），最终筛选出的最佳乳油配方为醇提物１４％、乳化剂（吐温－２０）１５％，溶剂（乙酸乙酯）７１％。
２．３ 醇提物乳油对植物病原菌的抑制作用
香榧假种皮醇提物乳油对５种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用测定结果（表３）表明，１０ ｍｇ／ｍＬ香榧假种皮醇提物乳油对５种供试植物病原真菌菌丝生长均有一定程度的抑制作用。其中对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制效果最佳，抑制率为８５．７０％；对黄瓜霜霉病菌、番茄早疫病菌、玉米小斑病菌、水稻稻瘟病菌的菌丝生长抑制率分别为７１．９２％、５０．４６％、５９．０２％、74．49％，其抑菌效果优于醇提物。
３ 小结与讨论
长期以来，香榧假种皮作为废物丢弃，既浪费了资源，又造成了环境的污染。已有研究表明，香榧假种皮富含多种活性成分，具有抑菌以及杀虫生物活性［７，８］。对香榧假种皮采用７０％乙醇回流提取活性成分，得到乙醇浸膏，制成不同浓度的溶液，并对其抑菌活性进行了测试。结果表明，不同浓度的醇提物对各供试菌菌丝生长的抑制活性普遍较高，其中对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制效果最佳，各浓度抑制率均在６2％以上。可见，香榧假种皮醇提物抑菌谱较广，且活性较强，具有较好的开发应用前景。同时也证实香榧假种皮含有抑菌活性化合物，具体成分和作用机理有待深入研究。
乳油是农药传统基本剂型之一，与其他农药剂型相比，乳油有效成分含量较高、贮存稳定性好、工艺简单，至今依然是国内和发展中国家主要使用的农药剂型。但由于有机溶剂用量大，容易污染环境，使用率有所下降。选择使用环境友好、生物降解性好、低刺激、高效率的绿色表面活性剂应用于乳油生产，有助于降低助剂对环境、农产品安全的潜在威胁［９］。本研究对香榧假种皮醇提物浸膏分别通过溶剂和乳化剂的筛选、乳油稳定性和分散性的测定，确定最佳配方，制备乳油对其抑菌活性进行测试。结果表明，香榧假种皮醇提物乳油在一定浓度（１０ ｍｇ／ｍＬ）下，对５种供试植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用， 且菌丝生长抑制率均高于醇提物。可见， 相同提取物含量的乳油抑菌效果更好。这与田秀玲［１０］报道的蛇床子乳油比提取液药效高的结论相符。在开发新型植物源杀菌剂方面，香榧假种皮醇提物具有较大的潜力， 可对其进行深入研究。
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参考文献：
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