张海霞１，卢永昌２，王 庶１
（１．青海民族大学化学与生命科学学院， 西宁 ８１０００７；２．青藏高原植物资源化学重点实验室，西宁 ８１０００７）
摘要：建立测定雪莲（Ｓａｕｓｓｕｒｅａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ）中绿原酸、芦丁和木犀草素含量的方法，采用ＨＰＬＣ法，色谱柱为Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），乙腈－０．８％磷酸水溶液进行梯度洗脱，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长３６０ ｎｍ，柱温３０ ℃。绿原酸、芦丁、木犀草素的线性范围分别为０．０８１～０．４０８ μｇ／ｍＬ、０．０９０～０．４４９ μｇ／ｍＬ、０．０４5～０．２２４ μｇ／ｍＬ；平均加样回收率分别为９９．７８％、９９．８９％、１００．７０％，其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高，木犀草素在苞叶雪莲中含量最高。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）；雪莲（Ｓａｕｓｓｕｒｅａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ）；绿原酸；芦丁；木犀草素
中图分类号：Ｒ２８４．２；Ｓ５６７ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０２－０434－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０２．０45
雪莲（Ｓａｕｓｓｕｒｅａ ｉｎｖｏｌｕｃｒａｔａ）又名雪荷花，为菊科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）凤毛菊属（Ｓａｕｓｓｕｒｅａ）植物，珍稀名贵中药材，常见的有苞叶雪莲、水母雪莲、天山雪莲、唐古特雪莲等，主要分布在２ ４００ ｍ以上的高原寒带地区的青海、新疆、甘肃、四川、西藏等地。雪莲性温、微苦，祛风除湿，通筋活血，暖宫散瘀效果显著。此外，对风湿性疾病具有特殊效果，还具有抗炎镇痛、止血消肿之功效，使用安全，无明显的不良反应［１－３］。药理研究显示芦丁、木犀草素和绿原酸为雪莲中的主要抗肿瘤抗癌有效成分［４-6］。对于芦丁、木犀草素和绿原酸在雪莲中的含量同时分析测定尚未见报道。为有效控制雪莲药材质量，本试验采用微波提取法对雪莲中芦丁、木犀草素和绿原酸进行提取，采用高效液相色谱法对芦丁、木犀草素和绿原酸的含量进行了测定，并比较了不同种雪莲药材３种物质的含量差异。该方法快速、简便、准确、重复性好，为雪莲药材的进一步研究和综合开发利用提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
雪莲系２０１２年８月采自青海、新疆（经高原生物研究所胡凤祖副研究员鉴定）。
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００型高效液相色谱仪，包括Ｇ１３１１Ａ四元输液泵，Ｇ１３１６Ａ柱温箱，Ｇ１３２９Ａ自动进样器，Ｇ１３１５Ａ二级管阵列（ＤＡＤ）检测器，Ａｇｉｌｅｎｔ１２００色谱工作站。
１．２ 试验试剂
芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，批号：１０００８０－２００７０７）、绿原酸标准品（中国药品生物制品检定所，批号：１１０７５３－２００２１２）和木犀草素标准品（中国药品生物制品检定所，批号：１１１５２０－２００５０４）；乙腈，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯；水为超纯水。
１．３ 色谱条件
色谱柱采用Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）； 流动相乙腈（Ａ）－０．８％ 磷酸水溶液（Ｂ） ，梯度洗脱（０～８ ｍｉｎ，１０％～１５％ Ａ；８～１２ ｍｉｎ，１５％～３０％Ａ；１２～３５ ｍｉｎ，３０％～３２％ Ａ）；检测波长３６０ ｎｍ；流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；进样１０ μＬ，柱温３０ ℃。
１．４ 溶液的配制
１．４．１ 标准品溶液制备 分别精密称取绿原酸 １０．２０ ｍｇ、芦丁 １１．２３ ｍｇ、木犀草素５．６０ ｍｇ，置于 ５０ ｍＬ容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配成质量浓度分别为２０４．０、２２４．６、１１２．０ ｍｇ／Ｌ的标准品储备液。
１．４．２ 供试品溶液的制备 精密称取雪莲药材粉末１．３０ ｇ，置具塞锥形瓶中，精密加入纯甲醇４０ ｍＬ，超声波处理２ ｈ，冷却，再称定重量，用纯甲醇补足减失重量，０．４５ μｍ微孔滤膜过滤即得。
２ 结果与分析
２．１ 系统适应性试验
分别吸取标准品溶液和供试品溶液，按“１．３”的色谱条件，分别进样１０ μＬ，记录色谱图。结果表明在此色谱条件下，绿原酸、芦丁、木犀草素分离良好，分离度均大于１．５，且理论塔板数均不低于４ ０００，结果见图１至图４。
２．２ 线性关系考察
精密吸取上述标准品储备液２．０、４．０、６．０、８．０、１０．０ ｍＬ，置于５０ ｍＬ量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀，配成系列质量浓度的标准品溶液。取１０ μＬ进样后记录峰面积，以质量浓度（μｇ／ｍＬ）为横坐标（Ｘ），以峰面积（Ｙ）为纵坐标绘制标准曲线，得到绿原酸、芦丁、木犀草素的回归方程。
绿原酸：Ｙ＝１２ ３１６Ｘ＋９９．５（ｒ＝０．９９９ ９）
芦丁：Ｙ＝１１ ２７６Ｘ＋２４６．５（ｒ＝０．９９９ ７）
木犀草素：Ｙ＝２２ ２７７Ｘ＋２０．８（ｒ＝０．９９９ ５）
结果表明，绿原酸、芦丁、木犀草素分别在０．０８１～０．４０８、０．０９０～０．４４９、０．０４5～０．２２４ μｇ／ｍＬ与峰面积线性关系良好。
２．３ 稳定性试验
用自动进样器依次对同一供试品溶液进样，在１、 ２、３ ｄ后分别进样１０ μＬ，以峰面积计算。结果表明，绿原酸的ＲＳＤ为１．２３％，芦丁的ＲＳＤ为１．３５％，木犀草素的ＲＳＤ为１．３０％，供试品溶液在３ ｄ内稳定。
２．４ 精密度试验
按“１．３”的色谱条件，绿原酸，芦丁和木犀草素的标准品溶液各进１０ μＬ，每种溶液测定６次，记录峰面积，绿原酸ＲＳＤ为０．８８％，芦丁ＲＳＤ为１．１８％，木犀草素ＲＳＤ为１．２２％，表明进样精密度良好。
２．５ 重复性试验
精密称取水母雪莲粗粉（过１００目）６份，按“１．４．２”制备样品溶液，用“１．３”的色谱条件，进样分析，记录峰面积，绿原酸的ＲＳＤ为０．８９％（ｎ＝６），芦丁的ＲＳＤ为０．８９％（ｎ＝６），木犀草素的ＲＳＤ为１．１１％（ｎ＝６）。
２．６ 加样回收试验
取已知绿原酸、芦丁和木犀草素含量的雪莲９份，分别在上述９份药材中加入绿原酸的标准品溶液（０．２０４ ｍｇ／ｍＬ）、芦丁标准品溶液（０．２２５ ｍｇ／ｍＬ）和木犀草素标准品溶液（０．１１２ ｍｇ／ｍＬ），按“１．４．２”制得供试品溶液，分别进样１０ μＬ，记录雪莲中绿原酸、芦丁和木犀草素的峰面积，计算含量，并计算回收率，结果见表１。
２．６ 样品测定
按“１．３”的色谱条件，分别精密称取３种雪莲药材粉末各１ ｇ，按上述方法测得绿原酸质量分数为０．１３２ １％～０．１９３ ３％，平均为０．１６０ ７％（ｎ＝８）；芦丁质量分数为０．１１３ ４％～０．２０２ ２％，平均为０．１７１ ２％（ｎ＝８）；木犀草素质量分数为０．０２０ ４％～０．０５８ ２％，平均为０．０３６ １（ｎ＝８），其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高，木犀草素在苞叶雪莲中含量最高（表２）。
３ 小结与讨论
雪莲中所含成分复杂，其理化性质相差较大，表现出较大的色谱行为差异。目前文献报道的多组分含量测定方法不甚理想，多有拖尾现象。考虑到绿原酸与芦丁２组分均具酸性，笔者通过调节流动相的ｐＨ，以抑制样品组分的解离，较好地改善了峰形［７］。同时，三者的极性差异较大，为了使各组分有较好的分离效果，采用梯度洗脱技术［８，９］。先后使用不同比例的甲醇、甲醇－磷酸、乙腈、乙腈－甲酸、乙腈－醋酸、乙腈－磷酸等，分离效果均不显著，分离度不达标，采用乙腈－０．８％磷酸水溶液梯度洗脱后，拖尾情况有较好改善，图谱特征性增强，目标峰的峰型和分离度均较好，故选择乙腈－０．８％磷酸水溶液为流动相［６］，用于梯度洗脱。
通过对３种雪莲样品中３种药效化合物的含量进行测定，结果表明，不同种雪莲有效成分含量有差异：木犀草素在苞叶雪莲中含量最高；绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高。可见，品种基因影响了药材有效成分的积累，根据有效成分的含量确定药材的品种是非常必要的，为今后雪莲的开发应用提供了必要的信息。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 庄 丽，李卫红，孟丽红．新疆雪莲资源的利用、研发与保护［Ｊ］．干旱区资源与环境，２００６，２０（２）：１９５－２０１．
［２］ 谢宗波，姜国芳．雪莲化学成分及药理作用研究进展［Ｊ］．食品科技，２０１０，２９（５）：４３８－４４０．
［３］ 袁晓凡，赵 兵，王玉春．雪莲的研究进展［Ｊ］．中草药，２００４，３５（１２）：１４２４－１４２６．
［４］ 张伟敏，张盛林，钟 耕．木犀草素的研究概况［Ｊ］．中国食品添加剂，２００５，６（２）：１１－１５．
［５］ 陈绍华，王亚琴，罗立新．天然产物绿原酸的研究进展［Ｊ］．食品科技，２００８，４（２）：１９５－１９８．
［６］ 陈 勇，李艳苓，李 立，等．ＨＰＬＣ法测定山绿茶不同炮制品种中绿原酸和芦丁的含量［Ｊ］．广西科学院学报，２００６，２２（４）： ４１６－４１８．
［７］ 董建辉，华 卡．高效液相色谱法同时测定天山雪莲中绿原酸和芦丁的含量［Ｊ］．中南药学，２００７，５（４）：３３３－３３５．
［８］ 刘海芳，魏东伟，刘全军，等．太行菊不同器官中绿原酸和４种黄酮类物质含量研究［Ｊ］．天然产物研究与开发，２０１３（５）：６４６－６５１，６７１．
［９］ 刘尤岩，周文芳，王玉忠，等．高效液相色谱法分离测定雪莲细胞中的黄酮［Ｊ］．药物分析杂志，２００５，２５（ｌ）：４０－４３．
（责任编辑 龙小玲）