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武陵山羊肚菌液体培养条件优化研究

  • 投稿杨纳
  • 更新时间2015-09-22
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刘达玉1,王慧超2,郑林用3,戴 玄2,李宗堂4,陈今朝2

(1.成都大学生物产业学院,成都 610106;2.长江师范学院生命科学与技术学院,重庆 408100;3.四川省农业科学院,成都 610066;4.成都榕珍菌业有限公司,成都 611733)

摘要:对武陵山羊肚菌(Morchella esculenta)的液体培养条件、培养基进行了优化。结果表明,最适液体培养条件为pH 6.0、培养液装量100 mL/250 mL、接种量8%、温度25 ℃、摇床转速180 r/min、培养时间6 d;最适发酵培养基为4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4和0.10% MgSO4·7H2O。在此条件下,菌丝体干重为6.880 g/L,胞外多糖产量为0.861 g/L。

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关键词 :武陵山羊肚菌(Morchella esculenta);液体培养;菌丝体;胞外多糖

中图分类号:Q949.32 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)02-0405-04

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.037

羊肚菌(Morchella esculenta)是一种营养丰富、美味可口的珍贵食药用菌,其性平、味甘,益肠胃、化痰理气,补肾、壮阳,补脑、提神,具有增强肌体免疫力、抗疲劳、抗衰老、降血脂、抗病毒和抑制肿瘤等功能[1,2]。虽然国内外已有一些羊肚菌人工栽培的报道,但由于其对气候、土壤等环境条件要求苛刻,至今仍未实现规模化栽培[3-6]。自然资源很少,远不能满足市场需求。为此,笔者分离重庆武陵山羊肚菌,并对其液体培养条件进行了优化,拟为其人工栽培、食品和药品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:武陵山羊肚菌,长江师范学院生物技术实验室分离保存。

母种PDA培养基:20%马铃薯(去皮)煮汁,2.0%葡萄糖,0.30%蛋白胨,1.8%琼脂,0.10% K2HPO4,0.05%MgSO4·7H2O,pH自然[7]。

液体种子培养基:10%马铃薯煮汁,2.0%葡萄糖,0.50%蛋白胨,0.10%K2HPO4,0.05%MgSO4,pH 6.0[8]。

发酵培养基:4.0%葡萄糖,0.50%蛋白胨,0.10%K2HPO4,0.05%MgSO4·7H2O,pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化 把保藏的羊肚菌母种转接到无菌PDA培养基平皿上,25 ℃培养7 d,备用。

1.2.2 液体培养方法 将种子培养液装入250 mL锥形瓶中,每瓶100 mL,0.10 MPa、121.3 ℃灭菌20 min,冷却,接羊肚菌母种于锥形瓶中,160 r/min、25 ℃培养3 d备用[9]。发酵培养液装量同种子培养液,培养条件相同,培养时间6 d。

1.2.3 发酵培养基选择 选取蔗糖、酵母粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O 4个因素,设计L9(34)正交试验,因素与水平见表1。通过试验,筛选最佳培养基配方。

1.2.4 菌丝体干重测定 取发酵液30 mL,在4 000 r/min离心10 min,沉淀菌丝体用去离子水洗涤3次,于70 ℃下烘干至恒重,称重,每个处理重复3次。

1.2.5 羊肚菌胞外多糖测定 参照武秋立等[10]的方法,取出菌丝体羊肚菌发酵液加入3倍乙醇于0 ℃下沉淀12 h,于4 000 r/min离心10 min;弃上清液,沉淀加少量乙醇再离心,重复两次后,将沉淀用去离子水溶解定容,用硫酸-蒽酮法于620 nm处测吸光度,根据硫酸-蒽酮葡萄糖标准曲线计算胞外多糖产量。

1.2.6 数据处理 试验数据用DPS 7.05版软件处理,用LSD法比较菌丝体干重和多糖的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 液体培养条件选择

2.1.1 pH对菌丝体干重和多糖产量的影响 用2.0 mol/L HCl或氢氧化钠溶液调节培养液pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,接种培养(表2)。当pH 6.0时,菌丝体生长最快,其干重和胞外多糖产量均最高; pH 6.0与pH 7.0菌丝体干重之间差异不显著,而pH 6.0与pH 5.0胞外多糖产量之间差异极显著;当pH 4.0时,菌丝体干重及多糖产量均最低。可见,菌丝体生长、多糖形成的最适pH为6.0。

2.1.2 培养液装量对菌丝体干重和多糖产量的影响 250 mL三角瓶分别装60、80、100、120、140 mL培养液(表3)。当培养液装量为100 mL时,菌丝体干重、多糖产量均最高;当装量为140 mL时菌丝体干重、多糖产量均最低。因此,最适装量为100 mL。

2.1.3 接种量对菌丝体干重和多糖产量的影响 培养液接种量分别为4%、8%、12%、16%、20%(表4)。当接种量8%时,菌丝体干重、多糖产量均最高;接种量8%与12%菌丝体干重、多糖产量之间均差异极显著;接种量20%时,菌丝体干重、多糖产量均最低。可见,最适接种量是8%。

2.1.4 温度对菌丝体干重和多糖产量的影响 培养温度分别为21、23、25、27、29 ℃(表5)。在25 ℃时,菌丝体干重、多糖产量均最高;在21℃时,菌丝体干重、多糖产量均最低。可见,最适培养温度是25 ℃。

2.1.5 转速对菌丝体干重和多糖产量的影响 将培养液置于摇床上振荡培养,转速分别设置为140、160、180、200、220 r/min(表6)。当转速为180 r/min时,菌丝体干重最重,180、200 r/min菌丝体干重之间差异显著;当转速为200 r/min时,多糖产量最高;而200、180 r/min多糖产量之间差异不显著。因此,最适转速为180 r/min。

2.1.6 培养时间对菌丝体干重和多糖产量的影响 培养液分别培养4、5、6、7、8 d(表7)。当培养6 d时菌丝体干重最重,培养6 d与7 d菌丝体干重之间差异极显著;培养8 d时多糖产量最高,培养8 d与7 d多糖产量之间差异不显著,而培养7 d与6 d多糖产量之间有极显著差异。因此,最适培养时间为6 d。

2.2 发酵培养基选择

2.2.1 碳源对菌丝体干重和多糖产量的影响 分别用4.0%可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇和麦芽糖代替发酵培养基中的葡萄糖为碳源(表8)。结果菌丝体干重在蔗糖培养基中最重,在可溶性淀粉培养基中最轻;多糖产量在可溶性淀粉培养基中最高,在麦芽糖培养基中最低。综合菌丝体干重和多糖产量,选蔗糖为最适碳源。

2.2.2 氮源对菌丝体干重和多糖产量的影响 分别用0.50%牛肉膏、酵母粉、硫酸铵和尿素代替发酵培养基中的蛋白胨(表9)。菌丝体干重、多糖产量在酵母粉培养基中均最高,二者在尿素培养基中均最低。因此,酵母粉是最适氮源。

2.2.3 无机盐对菌丝体干重和多糖产量的影响 分别用0.10% K2HPO4、CaSO4·0.5H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O代替发酵培养基中的K2HPO4和MgSO4·7H2O(表10)。在只有K2HPO4培养基中菌丝体干重、多糖产量均最高,但在K2HPO4与MgSO4·7H2O培养基中菌丝体干重、多糖产量之间差异不显著;在ZnSO4·7H2O培养基中菌丝体干重、多糖产量均最低。因此,最适无机盐是K2HPO4。

2.2.4 正交试验结果 由表11可知,以菌丝体为指标的培养基最优配方为A2B3C3D2;以多糖为指标的培养基最优配方为A2C3D3B2;两者结合并合并主次顺序选A2B3C3D2,即4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。但该培养基配方不在正交试验列表中,用该培养基配方进行验证试验,结果菌丝体干重为6.880 g/L,胞外多糖为0.861 g/L。

3 小结

武陵山羊肚菌的最适液体培养条件为pH 6.0、250 mL锥形瓶培养液装量为100 mL、接种量8%、温度25 ℃、摇床转速180 r/min,培养时间6 d。最适液体发酵培养基为4.0%蔗糖、0.70%酵母粉、0.15% K2HPO4、0.10% MgSO4·7H2O。在此优化条件下,菌丝体干重为6.880 g/L,多糖产量为0.861 g/L,菌丝体干重、胞外多糖产量分别比正交试验表中的最优配方A2B3C1D2高9.71%和19.09%。

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(责任编辑 龙小玲)