王桂清１，李凡海１，姬兰柱２
（１．聊城大学农学院，山东 聊城 ２５２０５９；２．中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳 １１００１６）
摘要：采用超临界ＣＯ２萃取辽细辛精油，硅胶柱层析法分离精油，气相色谱－质谱法分析其成分。以小菜蛾和淡色库蚊３龄幼虫为试虫，对辽细辛精油及各馏分的杀虫活性进行了比较。结果表明，各馏分的杀虫效果不同，馏分Ａ５成分比较简单，但其杀虫活性并不高；其他馏分（如Ａ１和Ａ６）的组成成分较多，然而它们的杀虫活性却较高，说明辽细辛精油中起杀虫作用的主要成分并非一种，可能多种成分均起作用。该结果为进一步研究和开发以辽细辛为原料的新型植物源杀虫剂奠定理论基础。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：细辛精油；ＧＣ－ＭＳ；硅胶柱层析；杀虫活性
中图分类号：Ｓ４８２．３ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0355-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.025
辽细辛（Ａｓａｒｕｍ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｏｉｄｅｓ Ｆｒ． Ｓｃｈｍｉｄｔ ｖａｒ． ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃｕｍ（Ｍａｘｉｍ）Ｋｉｔａｇ．）为马兜铃科多年生草本植物，又名北细辛、万病草、细参、烟袋锅花、东北细辛，属于重要的中草药，主产于中国东北，一直供应全国及出口，在国际市场上享有盛名［１］。细辛的药用部位为根及根茎，其主要的有效成分为挥发油即细辛精油［２，３］，近年来，它在农业生产上的价值也逐步显现。很多研究表明，细辛精油对昆虫可表现出不同程度的引诱、拒食、驱避、抑制生长发育及直接毒杀作用，具有良好的杀虫抑菌活性［４，５］。但研究限于未分离的细辛精油或主要单一成分如细辛醚等，而对于辽细辛精油不同馏分的杀虫活性鲜见报道。本研究采用超临界ＣＯ２萃取法提取了辽细辛精油，采用硅胶柱层析进行分离，同时使用气相色谱－质谱法（ＧＣ－ＭＳ）进行指纹图谱分析，以小菜蛾３龄幼虫和淡色库蚊３龄幼虫作为供试昆虫，比较了各馏分的杀虫活性，为研究和开发新型植物源杀虫剂提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试植物样品辽细辛的根购买于同仁堂药房，将其进一步阴干，粉碎，过３８０ μｍ孔径筛。供试昆虫包括粘小菜蛾（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）３龄幼虫和淡色库蚊（Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ ｐａｌｌｅｎｓ）３龄幼虫，均由沈阳化工研究院新药生测实验室提供。
１．２ 试验方法
１．２．１ 气相色谱条件 石英毛细管柱ＨＰ－５ＭＳ，５０ ｍ×０．２５ ｍｍ×０．２５ μｍ；程序升温：首先以８ ℃／ｍｉｎ升至１２０ ℃，再以２ ℃／ｍｉｎ升至１５０ ℃，最后以１０ ℃／ｍｉｎ升至２８０ ℃；载气：Ｈｅ；柱流量：０．９ ｍＬ／ｍｉｎ；进样量：１ μＬ；进样口温度：２５０ ℃；接口温度：２３０ ℃；柱压：８０ ｋＰａ；分流比：１０∶１。
１．２．２ 质谱条件 离子源为ＥＩ；电离能：７０ ｅV；离子源温度：２３０ ℃；质谱扫描范围：５０～５００ ａｍｕ；扫描周期：１ ｓ。
１．２．３ 精油提取方法 准确称取样品１．８５ ｋｇ，装入５ Ｌ的萃取罐内，采用超临界ＣＯ２进行萃取，萃取条件：压力２０ ＭＰａ，温度４０ ℃，流量２０ ｋｇ／ｈ；解析釜Ｉ压力６～７ ＭＰａ，温度４５ ℃；解析釜ＩＩ压力５～６ ＭＰａ，温度３５ ℃，萃取时间为６０ ｍｉｎ，每２０ ｍｉｎ收集提取物称量，密封，置４ ℃冰箱中保存备用。
１．２．４ 辽细辛精油的图谱分析 将所得到的辽细辛精油用乙酸乙酯溶解后进行ＧＣ－ＭＳ分析鉴定。
１．２．５ 硅胶柱层析分离 采用硅胶柱层析法对超临界ＣＯ２萃取法得到的细辛精油进行了分离。柱长５０ ｃｍ，直径５ ｃｍ。硅胶为青岛海洋化工厂分厂生产，型号为粗孔ＺＣＸ－Ⅱ，粒度１０９～１５２ μｍ。装好柱后，将１０ ｍＬ精油从最上端倒入，等精油被硅胶吸附后，用石油醚与乙酸乙酯的混合液进行洗脱，石油醚与乙酸乙酯的比例依次为８∶１、６∶１、４∶１、２∶１和１∶１。用２０ ｍＬ指形管接洗脱液，指形管事先编号，同时跟踪试样洗脱情况，即每接１管洗脱液，用毛细管吸取少量点滴在层析板上，在紫外灯下观察显色情况。最后将显色的洗脱液全部点滴在层析板上进行层析，根据层析情况，合并洗脱液。
１．２．６ 杀虫活性测定方法 采用叶碟法测定辽细辛精油对小菜蛾幼虫的活性。挑选长势良好、无药的甘蓝嫩叶，用湿布擦干净，再将甘蓝嫩叶用打孔器打成直径２ ｃｍ的叶碟，放到直径６ ｃｍ铺有滤纸的培养皿中，１皿１个叶碟，编号。用喷雾器将细辛精油药液（浓度分别为４ ０００、３ ０００、２ ０００、１ ０００和５００ ｍｇ／Ｌ）喷在叶碟上，正反面喷均匀，用药量约０．５ ｍＬ，自然晾干。然后接入供试小菜蛾幼虫１０头，３ 次重复，于２４ ｈ调查试虫的死亡率，计算ＬＣ５０。以喷含吐温－８０的蒸馏水为对照。采用浸渍法测定辽细辛精油对淡色库蚊幼虫的杀伤作用。先将２４孔培养板编号，分别在孔中加入带有蚊幼虫２０条左右的水１．２０、１．６０、１．８０、１．９０和１．９５ ｍＬ，再加入２００ ｍｇ／Ｌ的母液０．８０、０．４０、０．２０、０．１０和０．０５ ｍＬ，终体积为２ ｍＬ，终浓度为８０、４０、２０、１０和５ ｍｇ／Ｌ。在温度（２５±１） ℃，相对湿度６０％～８０％，光照（Ｌ∶Ｄ＝１６ ｈ∶８ ｈ）的条件下培养２４ ｈ检查结果，计算ＬＣ５０。振动培养板，并用镊子轻触蚊幼虫身体，以沉入孔底部不动者为死亡。每个样品重复３次，每次均以２％乙醇浸渍蚊幼虫作为空白对照。
２ 结果与分析
２．１ 辽细辛精油的指纹图谱分析
辽细辛根采用超临界ＣＯ２提取后，１．８５ ｋｇ的原料共萃取得到４２ ｇ精油，萃取率为２．２７％。精油萃取效率较高，品质较好，颜色为棕黄色。该精油指纹图谱如图１。由图可见，超临界ＣＯ２萃取得到的辽细辛精油的组成成分较多，能够确定峰值的就超过３５种，如果把次要的小峰也算入的话，辽细辛精油的组成成分将超过４０种。
２．２ 辽细辛精油的分离
超临界ＣＯ２萃取法得到的精油（标记为Ａ０）经过硅胶柱层析后，初次得到６个馏分，即Ａ１－Ａ６。这６个馏分的质谱图如图２-７。从指纹图谱看，这６个馏分仍然是混合物，其中馏分Ａ５成分较少。
２．３ 不同馏分杀虫活性比较
辽细辛超临界ＣＯ２萃取的精油（Ａ０）及各馏分杀虫活性的结果如表１。从表中可以看出，各馏分的杀虫效果不同，其中馏分Ａ６的杀虫活性最好，对小菜蛾和淡色库蚊的ＬＣ５０分别为８９２．８ ｍｇ／Ｌ和１．２７ ｍｇ／Ｌ，与萃取精油（Ａ０，对２种试虫的ＬＣ５０分别为１ ４０８．０ ｍｇ／Ｌ和２５．０５ ｍｇ／Ｌ）相比，其杀虫活性分别提高３６．５９％和９４．９３％；对小菜蛾的杀虫活性比Ａ０高的馏分还有Ａ１、Ａ２和Ａ３，ＬＣ５０分别为１ ２１８．２ ｍｇ／Ｌ、１ ２７４．７ ｍｇ／Ｌ和１ ３５２．０ ｍｇ／Ｌ，杀虫活性分别提高１３．４８％、９．４７％和３．９８％；对淡色库蚊的杀虫活性比Ａ０高的馏分还有Ａ１和Ａ４，ＬＣ５０分别为６．３１ ｍｇ／Ｌ和７．９４ ｍｇ／Ｌ，杀虫活性分别提高７４．８１％和６８．３０％；杀虫活性最低的是馏分Ａ５，对小菜蛾和淡色库蚊的ＬＣ５０分别为５ ７０５．８ ｍｇ／Ｌ和１１４．８７ ｍｇ／Ｌ，与萃取精油（Ａ０）相比，其杀虫活性显著降低；对小菜蛾的杀虫活性比Ａ０低的馏分还有Ａ４，ＬＣ５０为１ ５０４．１ ｍｇ／Ｌ，杀虫活性降低６．40％；对淡色库蚊的杀虫活性比Ａ０低的馏分还有Ａ２和Ａ３，ＬＣ５０分别为４８．７４ ｍｇ／Ｌ和６２．３６ ｍｇ／Ｌ，杀虫活性显著降低。
从表１还可以看出，同一馏分对不同试虫的杀虫效果不同，如Ａ２和Ａ３，与Ａ０比较，对小菜蛾的杀虫活性均提高，提高率分别为９．４７％和３．９８％，而对淡色库蚊的杀虫活性均降低，说明同种物质对不同试虫的杀虫效果不同。
结合图２－７及表１可以看出，馏分Ａ５成分比较简单，但其杀虫活性并不强，而其他馏分（如Ａ１和Ａ６）虽然组成成分较多，且组成成分存在差异，但其杀虫活性却较高，说明辽细辛精油中起杀虫作用的主要成分并非是单一的化合物，但具体情况，有待于今后的继续探索。
３ 小结与讨论
采用超临界ＣＯ２法萃取了辽细辛精油，并进行了ＧＣ－ＭＳ指纹图谱分析，结果表明辽细辛精油是由多种成分组成的混合物，成分较多，能够标定峰值的有３５种。采用硅胶柱层析法对辽细辛精油进行了分离，初步得到６个馏分，其指纹图谱表明，各馏分均为混合物，馏分Ａ５成分较少。以小菜蛾和淡色库蚊为试虫，对辽细辛精油及各馏分的杀虫活性进行了比较，表明各馏分的杀虫效果不同，与萃取精油比较，杀虫效果或提高或降低，馏分Ａ５成分比较少，但其杀虫活性并不强，而其它馏分（如Ａ１和Ａ６）虽然组成成分较多，且组成成分存在差异，但其杀虫活性却较高，说明辽细辛精油中起杀虫作用的主要成分并非是单一的一种化合物，可能多种成分均起作用，但具体情况有待于继续探索。
细辛属于重要的中草药，在医药上应用广泛的，其精油（挥发油）在动植物虫害上也有一定的应用。杨银书等［６］研究了８种植物（川芎、细辛、前胡、橘皮、藿香、当归、石菖蒲、薄荷）精油对媒介硬蜱的驱避效果，结果表明细辛精油对草原革蜱（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ ｎｕｔｔａｌｌｉｉ）、日本血蜱（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、青海血蜱（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ ｑｉｎｇｈａｉｎｅｓｉｓ）、血红扇头蜱（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｏｕｓ）若虫和成虫具有较好的麻痹及驱避作用。莫建初等［７］以黄胸散白蚁（Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｆｌａｖｉｃｅｐｓ）为对象，在室内对细辛的抗白蚁效果作了研究，结果表明华细辛（Ａｓａｒｕｍ ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ Ｍｉｑ．）粉对黄胸散白蚁不仅有较强的毒杀效果，而且有驱避活性；刘树民等［８］研究显示，北细辛挥发油对栖北散白蚁具有较好的驱避作用和熏蒸活性；尹红等［９］发现北细辛醇提物与挥发油对栖北散白蚁也有较好的触杀效果。韩俊艳等［１０］研究表明，北细辛挥发油在８ μｇ／ｍＬ 时对二斑叶螨的熏蒸毒性最强，２４、４８ ｈ的螨死亡率分别为７２．６％和１００％。细辛精油及单一成分对蚊虫的生物活性，学者们研究的较多，王桂清等［１１］研究证明辽细辛精油对淡色库蚊幼虫有较强的毒杀作用，对其成虫有较好的熏蒸作用；Ｐｅｒｕｍａｌｓａｍｙ等［１２，１３］发现细辛对淡色库蚊的成蚊与蚴蚊具有杀灭作用，其提取物有望开发成杀虫剂；张静等［１４，１５］的研究证明，细辛醚对家蝇、淡色库蚊和部分农业害虫有明显的杀虫效果，细辛醚对昆虫的致毒症状与神经毒剂类似；本研究也证明，辽细辛精油及馏分均具有一定的杀虫活性，作为植物源杀虫剂有一定的研究前景。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 中国药典委员会．中华人民共和国药典一部［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００５．
［２］ 吴艳蓉，贾凌云，高福坤，等．不同产地和采收期辽细辛挥发油的含量测定［Ｊ］．沈阳药科大学学报，２００６，２３（５）：２８５－２８８．
［３］ 鄢景森，李景辉，贾 超．细辛的资源开发利用与研究进展［Ｊ］．辽宁科技学院学报，２０１０，１２（３）：４３－４５．
［４］ 刘学文，徐汉虹，鞠 荣，等．植物精油在农药领域中的研究进展［Ｊ］．香料香精化妆品，２００４，（２）：３６－３９．
［５］ 陈阳峰，钟晓红．中国中草药源农药的应用开发进展［Ｊ］．农药， ２０１３，５２（１０）：７１７－７２０．
［６］ 杨银书，刘增加，张继军，等．８种植物精油对媒介硬蜱的驱避效果研究［Ｊ］．医学动物防制，２００２，１８（５）：２３４－２３５．
［７］ 莫建初，张时妙，滕 立，等．细辛对黄胸散白蚁的毒效［Ｊ］．农药学学报，２００３，５（４）：８０－８４．
［８］ 刘树民，罗明媚，杜心懿，等．细辛挥发油对栖北散白蚁毒效作用［Ｊ］．中药材，２００６，２９（６）：５３９－５４１．
［９］ 尹 红，杜心懿，刘树民，等．细辛醇提物对栖北散白蚁的毒效及含量测定研究［Ｊ］．中华卫生杀虫药械，２００７，１３（４）：２６３－２６６．
［１０］ 韩俊艳，王 军，韩 雪，等．北细辛挥发油对二斑叶螨的毒性及其酶的影响［Ｊ］．天然产物研究与开发，２０１２，２４（４）：５２５－５２８．
［１１］ 王桂清，姬兰柱，张 弘．辽细辛精油对淡色库蚊的杀伤作用［Ｊ］．中国生物防治，２００８，２４（２）：１１２－１１５．
［１２］ ＰERUMALSAMY Ｈ， ＫIM Ｎ Ｊ， ＡHN Ｙ Ｊ． Ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｓａｒｕｍ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｏｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ ｐａｌｌｅｎｓ， Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ， ａｎｄ Ｏｃｈｌｅｒｏｔａｔｕｓ ｔｏｇｏｉ （Ｄｉｐｔｅｒａ： Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ２００９， ４６（６）：１４２０－１４２３．
［１３］ ＰERUMALSAMY Ｈ， ＣHANG Ｋ Ｓ， ＰARK Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｓａｒｕｍ ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｏｉｄｅｓ ｒｏｏｔ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｕｌｅｘ ｐｉｐｉｅｎｓ ｐａｌｌｅｎｓ ａｎｄ Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ ａｎｄ Ｏｃｈｌｅｒｏｔａｔｕｓ ｔｏｇｏｉ［Ｊ］． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ， ２０１０，５８（１８）： １０００１－１０００６．
［１4］ 张 静，冯 岗，马志卿，等．细辛醚对六种农业害虫的生物活性［Ｊ］．西北农林科技大学学报（自然科学版），２００８，３６（４）： １６６－１７０．
（责任编辑 彭西甜）