刘雅芳１，侯冠彧２，于 萍１，赵春萍１，曹 婷２，张立岭１，３
（１．海南大学农学院动物科学系，海口 ５７０２２８；２．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州 ５７１７３７；３．海南蟒蛇研究所，海南 文昌 ５７１３４６）
摘要：为了更有效地保护、管理和繁育缅甸蟒（Ｐｙｔｈｏｎ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ）濒危物种，有必要利用分子技术对地方物种多样性和遗传分化进行研究。试验采用ＴＡ克隆双向测序方法对来自海南的３７条缅甸蟒和来自越南的２８条缅甸蟒部分控制区ＩＩ序列进行了测定。结果表明，两个地理群体共分为２５个单倍型，单倍型多样度（Ｈｄ）为０．８７７±０．０２５，核苷酸多样性（π）为０．００４ ７６±０．０００ ４１，平均核苷酸差异数（ｋ）为２．６７６，显示缅甸蟒整体遗传多样性不高；通过比较两群体遗传多样性，发现海南缅甸蟒的单倍型多样度要高于越南缅甸蟒，但核苷酸多样性和平均核苷酸差异数低于越南缅甸蟒；基于控制区构建ＭＬ树和Ｎｅｔｗｏｒｋ网络分析显示，两群体均各自形成了明显的两大分支；通过计算得到两群体的固定指数（Ｆｓｔ）为０．２０１（Ｐ＜０．００１），显示海南缅甸蟒与越南缅甸蟒存在极显著差异。
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关键词 ：缅甸蟒（Ｐｙｔｈｏｎ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ）；控制区；遗传多样性；差异性
中图分类号：Ｑ９５９．６；Ｑ７８ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0398-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.035
缅甸蟒（Ｐｙｔｈｏｎ ｂｉｖｉｔｔａｔｕｓ）主要分布于东南亚国家和中国海南、云南、广东、广西、福建、四川等地［１］，是国家一级保护动物，被列于《濒危动植物种国际贸易公约》（ＣＩＴＥＳ）附录ＩＩ。缅甸蟒用途广泛，蟒皮可用来制作民族乐器、高档皮具，据统计，２０００-２０１０年缅甸蟒皮的出口量仅在越南就已达到年平均１０万张［２］；蟒油具有疏通经脉、消肿抑菌等作用［３］；蟒蛇胆具有止咳、祛痰、平喘等作用［４］。此外，缅甸蟒因性情温顺可爱，也是世界流行的宠物。如此大的市场需求，导致野生蟒蛇急剧减少，加上蟒蛇传统栖息地面积的萎缩和数量的减少，使蟒蛇成为濒危物种。有数据显示，中国大陆的野生蟒蛇仅约６２ ０００条，且数量仍在减少［５］。
海南岛位于中国南部，与越南隔海相望。岛屿具有与陆地界限明确、受陆地物种影响小等独有特点，因此是研究物种进化、演替和新物种形成的绝好地理环境。海南岛蟒蛇具有这些特征。目前，关于越南缅甸蟒线粒体基因组全序列和来自海南缅甸蟒线粒体基因组全序列已经公布［６］，通过比对发现其在控制区ＩＩ位置变异最大。此外，人们在饲养过程中，发现同龄海南缅甸蟒与越南缅甸蟒在个体大小和生长速度上有显著性差异，因此有必要利用分子技术探讨这两种缅甸蟒遗传差异。
国内外学者利用线粒体上控制区、ＣＹＴＢ以及微卫星标记对缅甸蟒遗传多样性进行了研究［７－９］，取得了一定的研究成果，对于地方种群的来源、结构、种群多样性以及对入侵种群的管理有一定的参考价值，但目前关于海南缅甸蟒种群遗传多样性的研究国内外尚未见报道。为了更有效地保护、管理和繁育缅甸蟒濒危物种，特别是海南缅甸蟒，有必要采用现代分子遗传技术对种群进行群体遗传结构、遗传分化分析。本试验通过测定中国海南岛和越南的缅甸蟒控制区ＩＩ ３′端序列，研究两地方种群缅甸蟒遗传多样性，探讨海南与越南缅甸蟒遗传结构及遗传差异，以期能为海南和越南缅甸蟒的正确区分提供重要的科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 样本采集
本试验从海南蟒蛇研究所的１０ ０００条蟒蛇中随机抽取海南缅甸蟒３７条、越南缅甸蟒２８条，采用心脏采血法每条抽取１．５ ｍＬ血液，柠檬酸钠抗凝，立即提取总 ＤＮＡ（参照天根 ＤＰ３０４离心柱型基因组提取试剂盒说明书操作），检测样品浓度和纯度，并稀释至１００ ｎｇ/μＬ，－２０ ℃分装保存。
１．２ ＰＣＲ扩增及克隆测序
ＰＣＲ扩增引物，上游引物序列为：５′－ＣＴＣＣＧＡＡＴＡＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣ－３’；下游引物序列为：５′–ＴＴＧＴＴＧＣＣＧＣＴＴＣＴＧＴＧＧ－３′。ＰＣＲ扩增体系为５０ μＬ：Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ混合液２５ μＬ，总ＤＮＡ模板１００ ｎｇ，最后补水至５０ μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性３ ｍｉｎ；９４ ℃ 变性３０ ｓ，５０ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物经１％凝胶电泳检测，回收目的条带。将目的条带进行克隆测序。具体步骤：Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用下１６ ℃过夜→连接至ＰＭＤ２０－Ｔ载体→转化至大肠杆菌 ＤＨ５α→ＬＢ培养基培养1２ ｈ→挑取阳性克隆菌落→菌落ＰＣＲ验证→提取质粒→生工生物工程（上海）股份有限公司ＡＢＩ３７３０型全自动测序仪双向测序。
１．３ 序列分析
所得序列用ＤＮＡＳＴＡＲ ７．１０中的ＳｅｑＭａｎＩＩ进行序列校对及拼接。用ＢｉｏＥｄｉｔ７．０软件进行多重比对，ＤｎａＳＰ３．０统计多态位点、简约性位点、单倍型、核苷酸多样性（π）、单元型多样性（ｈ）、平均核苷酸差异数（ｋ）及中性检验。用ＭＥＧＡ ３．１基于Ｋｕｍａｒ ２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型进行种群内遗传距离及分子系统分析，进化树中节点的自举置信度水平由自引导值（Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅ）估计，重复次数为１ ０００。利用Ａｒｌｅｑｕｉｎ ３．０１软件中分子方差分析（ＡＭＯＶＡ）估算两群体间的固定指数（Ｆｓｔ）。用Ｎｅｔｗｏｒｋ进行单倍型网络关系分析。
２ 结果与分析
２．１ 缅甸蟒控制区遗传多样性
在６５条序列中，碱基组成如下：Ｔ为２３．９％， Ｃ为 ２７．２％，Ａ为３７．８％，Ｇ为１１．０％。Ａ＋Ｔ明显高于Ｃ＋Ｇ。共发现３８个多态位点，包括３６个单变异位点和２个简约性位点。转换与颠换比为５．３５。所有序列均已提交至ＧｅｎBａｎｋ（登录号：ＫＦ９９１０１７－ＫＦ９９１０８１）。
除去控制区内串联重复序列，得到长度５７０ ｂｐ左右的６５条序列。共定义２５个单倍型（表１），其中单倍型Ｈａｐ３频率最高，为２４．６％。其次是单倍型Ｈａｐ１６和Ｈａｐ１７，均为１８．５％。６５条缅甸蟒单倍型多样度（Ｈｄ）、核苷酸多样性（π）和平均核苷酸差异数（ｋ）见表２。基于Ｋｉｍｕｒａ ２ ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型计算６５条缅甸蟒种群内遗传距离在０．００２～０．０１６之间。
２．２ 海南与越南缅甸蟒控制区差异
从表２可知，３７条海南缅甸蟒控制区序列分为１２个单倍型，单倍型比例为３２．４％；２８条越南缅甸蟒控制区序列分为１５个单倍型，单倍型比例为５３．６％。海南缅甸蟒的单倍型多样度要高于越南缅甸蟒，但核苷酸多样性和平均核苷酸差异数低于越南缅甸蟒。群体固定指数Ｆｓｔ值在０.00～０．０５之间，表明其各亚群间不存在分化；Ｆｓｔ值在０．０５～０．１５之间，为中度分化；Ｆｓｔ值在０．１５～０．２５之间，则为高度分化［１０］。计算得出海南与越南缅甸蟒两群体间的Ｆｓｔ值为０．２０１（Ｐ＜０．００１），遗传距离为０．００７，核酸歧义度（Ｄｘｙ）为０．００６ ５６±０．０００ ９０，显示两群体间存在极显著差异。
２．３ 缅甸蟒分子进化与单倍型网络关系分析
利用６５条缅甸蟒控制区序列构建ＭＬ分子系统树（图１）。由图１可知，海南缅甸蟒与越南缅甸蟒分为明显的两大分支（除Ｙ９个体在海南缅甸蟒分支中和Ｈ２４、Ｈ３４个体在越南缅甸蟒分支中）。
对６５条序列进行单倍型网络关系分析（图２），网络以Ｈａｐ３、Ｈａｐ１６、Ｈａｐ１７为中心。经中性检验，Ｔａｊｉｍａ’ｓ Ｄ为－２．１８０ ５０（Ｐ＜０．０１）、Ｆｕ＇ｓ Ｆｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃ为－１６．９６３及Mｉｓｍａｔｃｈ分析图为单峰，表明缅甸蟒曾经历过群体扩张事件。
３ 小结与讨论
３．１ 缅甸蟒的遗传多样性及保护
从表２中可以看出，缅甸蟒总体上群体遗传具有较高的单倍型多样度，但是表现出较低的核苷酸多样性，显示群体遗传多样性并不高。遗传多样性是一个种群进化和生存的重要基础，遗传多样性的缺失会威胁到种群的生存。加上栖息地的缺失和人类的大量捕杀，缅甸蟒濒危物种数量急剧下降。缅甸蟒的基因多样性匮乏也给缅甸蟒的人工驯养及繁殖带来一定的困难。在人工养殖中，应加强遗传管理，建立清晰详细的谱系关系，防止近亲衰退。同时可以引入遗传多样性高的种群，或将各农户的蟒蛋、幼蟒、种蟒进行交换来提高本地蟒蛇种群基因交流程度，提高本地种群的遗传多样性。
３．２ 海南与越南缅甸蟒遗传分化
对比海南与越南缅甸蟒控制区ＩＩ序列分析可知，相对于越南缅甸蟒来说，海南缅甸蟒的单倍型多样度高，核苷酸多样性和平均核苷酸差异数低，根据Ｗｒｉｇｈｔ的遗传平衡理论，推测海南缅甸蟒可能是由一个小种群迅速增长，长期的地理和时间隔离，导致随机的遗传漂移，引起单倍型多样度增大，但是没有累积核苷酸方面的多态性［１１］。构建分子系统树对于鉴别物种来源具有重要的参考价值。图１中分子系统树将６５条缅甸蟒分为两大支，其中一支海南缅甸蟒个体占９７．２％，另一支越南缅甸蟒占９３．１％，地理位置几乎与ＭＬ分子系统树完全对应，表明海南与越南缅甸蟒起源于两个不同的母系。进一步利用Ｍｅｄｉａｎ Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建单倍型网络分析图，发现缅甸蟒分为３个主要的单倍型，Ｈａｐ３、Ｈａｐ１６和Ｈａｐ１７。其中Ｈａｐ３由８７．５％越南缅甸蟒组成，Ｈａｐ１６、Ｈａｐ１７ １００％由海南缅甸蟒组成。在单倍型网络分析图中也可看出海南与越南两个明显的区域，说明海南与越南缅甸蟒在线粒体基因组的遗传分化方面确实有明显的差异，反映出这两个群体在进化过程中产生的不同遗传特征。
计算得出海南与越南缅甸蟒Ｆｓｔ为０．２０１，结果也表明两个地理种群已出现较明显的种群分化。海南与越南同属热带季风气候，地理位置仅有一北部湾之隔，构成了地理上的隔离。日积月累，使缅甸蟒在这两个地方种群产生了极显著的分化。Ｃｏｌｌｉｎｓ等［７］利用ＣＹＴＢ和控制区基因分析１５６条美国大沼泽地国家公园缅甸蟒，发现其群体内遗传分化很小，并与越南缅甸蟒群体Ｆｓｔ为０．０８８，呈现中度分化。Ｙｏｕ等［９］利用来自台湾金门的２６条缅甸蟒、来自福州的２条缅甸蟒和来自越南的５条缅甸蟒的ＣＹＴＢ和ＣＯＩ基因探讨了台湾金门岛缅甸蟒起源，发现金门岛与福州缅甸蟒最为接近，两者都与越南缅甸蟒亲缘关系较远，否认了金门岛上缅甸蟒来自东南亚地区。
对于不同物种，其表观形态差距大，较易区分开。但是对于同一物种不同地域种群来说，很难通过形态特征来加以区分和研究。利用控制区序列来构建分子系统树，可以大致区分本地种和外来种，消除外来物种的基因可能混杂当地种群的潜在风险，也为野生动物保护监管机构及海关检验蟒蛇的来源提供了一个生物学检测方法。这种方法类似于现在ＤＮＡ条形码概念，不同的是ＤＮＡ条形码大多数用于种及种以上的分类和鉴定，对于种内来源鉴别很少［１２，１３］。而控制区是线粒体上进化最快的区域，常用来研究种内遗传分化和多样性［１４－１６］。总之，通过构建分子系统树、单倍型网络分析图和计算两群体间的固定指数Ｆｓｔ，均已表明海南与越南缅甸蟒在分子水平上已出现明显的分化。
本试验对海南和越南两个地理种群缅甸蟒进行了遗传多样性和遗传差异研究，得出整体缅甸蟒群体遗传多样性并不高，但海南与越南缅甸蟒在分子水平上已出现明显的分化。本研究成果对保护蟒蛇资源、鉴别蟒蛇活体及其产品的来源、人工养殖、种群管理等将具有重要的理论意义和应用价值。
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（责任编辑 曾德芳）