李德莹ａ，田毅红ｂ，龚大春ｃ
（三峡大学，ａ．材料与化工学院；ｂ．生物与制药学院；ｃ．新能源研究院，湖北 宜昌４４３００２）
摘要：以汽爆秸秆为底物，分别考察添加Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋和Ｆｅ３＋四种金属离子对纤维素酶解性能的影响。结果表明，金属离子的种类、用量均会影响纤维素的酶解效率。其中Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋对纤维素降解有促进作用，当Ｆｅ２＋浓度为０．６ ｍｇ／ｍＬ时，对纤维素降解促进作用最明显。Ｍｇ２＋和Ｆｅ３＋则会抑制纤维素酶解。考察了纤维素酶在水解过程中的吸附过程，添加Ｆｅ２＋可加快纤维素酶的吸附，促进纤维素酶与纤维素的有效结合。
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关键词 ：纤维素酶；金属离子；水解；激活；吸附
中图分类号：Ｑ８１４．９文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－05４６-0４
纤维素是一种可再生资源，它来源于农业废弃物如稻草、稻壳、麦秆等，木材废弃物如木屑、树皮以及城市废弃物等。全国每年仅农作物秸秆约有７亿ｔ，其中作为农村燃料消耗２亿ｔ。若将其余５亿ｔ用来生产纤维素乙醇，可产乙醇７ ０００万ｔ，若再加上木材工业下脚料、制糖造纸工业下脚料和城市废纤维垃圾等，纤维素乙醇的生产原料非常丰富，生产潜力巨大。目前，生物乙醇主要用于制备乙醇汽油。生物乙醇还将广泛应用于燃料电池市场，作为燃料电池动力的主要来源。此外，乙醇是生产乙烯的理想原料，随着石油资源的枯竭，乙醇必将代替石油成为乙烯工业的主要原料，在化学合成工业上发挥巨大的作用。因此，无论从短期的燃料市场来看，还是从长期的化纤合成工业来分析，生物乙醇都将拥有广阔的市场前景，是发展潜力巨大的绿色能源［１－３］。
木质纤维素水解是纤维素乙醇的关键技术之一。利用纤维素酶进行纤维素水解，可以避免酸水解工艺的高温高压苛刻条件，也可以防止对生产设备的腐蚀，但其缺点是反应速度慢、生产周期长、酶成本高。因此，设法提高纤维素酶的活力可以提高转化率，降低生产成本。目前报道较多的金属离子对纤维素酶的影响基本都采用游离酶作为考察对象，没有涉及到反应体系中的酶，对实际应用意义不大［４－８］。本研究考察纤维素水解过程中金属离子的调控效应，以期提高纤维素酶的利用率。
１材料与方法
１．１材料
汽爆秸秆由三峡大学材料与化工学院实验室提供。
１．２方法
１．２．１汽爆秸秆的处理用８０ ℃左右的热水蒸煮汽爆秸秆，洗去其中含有的糠醛等杂质，将滤渣收集并烘干，用研钵研碎并过４０目筛。处理完成后，用密封袋贮藏。
１．２．２金属离子对汽爆秸秆水解的影响准确称取过筛后汽爆秸秆渣１０ ｇ和０．３５ ｇ纤维素酶置于２５０ ｍＬ锥形瓶中，加入１００ ｍＬ ｐＨ ４．８的乙酸－乙酸钠缓冲液充分搅拌，添加不同种类、浓度的金属离子，于５０ ℃恒温振荡水浴４８ ｈ，测还原糖含量，计算水解率。
１．２．３金属离子对酶与底物吸附的影响每隔０、５、１０、１５、３０、６０、９０ ｍｉｎ吸取水解液２ ｍＬ于离心管中，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ。取上清液适当稀释后测蛋白质含量。溶液中初始蛋白质含量与滤液中蛋白质含量之差即为吸附的蛋白质含量。
１．２．４测定方法还原糖的测定采用ＤＮＳ法［９］。纤维素酶活性测定采用滤纸酶活法［１０］，即ｐＨ ４．８、５０ ℃下１ ｇ固体酶１ ｈ内水解滤纸生成１ ｍｇ的葡萄糖为一个滤纸酶活单位（ＦＰＡ）。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法［８］。所有的数据测定做２个平行样，取平均值。纤维素结构测定：将水解４８ ｈ后的水解液抽滤，收集滤渣，置于烘箱中干燥。干燥后用密封袋储存样品，待进行红外光谱检测。红外分析采用ＫＢｒ压片法， 扫描范围４ ０００ ～４００ ｃｍ－１。
２结果与分析
２．１Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋对汽爆秸秆酶解的影响
由图１、图２可知，在Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋浓度分别为０．４ 、０．８ 、１．２ 、１．６ ｍｇ／ｍＬ的情况下，随着水解时间的增加，汽爆秸秆的水解率逐渐增大，在相同的水解时间里，与对照组相比，加入Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋的浓度越大，水解率越低。这说明Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋对纤维素酶解有抑制作用，且随金属离子浓度的增大，抑制作用越明显。Ｆｅ３＋的抑制作用可能是由于Ｆｅ３＋的存在不利于底物与酶的活性中心相结合；Ｍｇ２＋的抑制机理与Ｆｅ３＋的抑制机理相似［１１－１２］。
２．２Ｆｅ２＋对汽爆秸秆酶解的影响
如图３所示，随水解时间增加，汽爆秸秆的水解率逐渐增大，在相同的水解时间里，与对照组相比，当加入Ｆｅ２＋浓度为０．２ ｍｇ／ｍＬ时，其水解率较低，当加入Ｆｅ２＋浓度为０．４、０．６ ｍｇ／ｍＬ时，水解率增大，且０．６ ｍｇ／ｍＬ Ｆｅ２＋对汽爆秸秆的水解促进作用最强，当Ｆｅ２＋浓度继续增大到１．０ ｍｇ／ｍＬ，水解率反而降低。这种现象可能是由于当Fe2+浓度较低时，Fe2+在酶与底物之间起了连桥作用，形成了Ｅ－Ｍ－Ｓ复合物。从而更有利于底物与酶的活性中心必需基团的结合，因而使酶活力得到提高。而当离子浓度过高时，激活作用逐渐减弱，甚至呈现抑制作用。
２．３Ｃｕ２＋对汽爆秸秆酶解的影响
如图４所示，与对照组相比，在水解相同的时间里，当加入Ｃｕ２＋浓度为０．２、０．６、１.0 ｍｇ/ｍＬ时，水解率都有所增加，其中Ｃｕ２＋浓度为０．６ ｍｇ/ｍＬ时，水解率增加最大，而当Ｃｕ２＋浓度增加为１．４ ｍｇ/ｍＬ，水解率变化不大，若Ｃｕ２＋浓度继续增大，可能会抑制纤维素水解。低浓度的Ｃｕ２＋对酶解过程的促进作用可能是由于Ｃｕ２＋的存在更有利于底物与酶的活性中心相结合，从而使酶活力得到提高，水解率也相应增大。而当其浓度增大到一定值，由于Ｃｕ２＋的重金属作用，使蛋白质变性，酶逐渐失活，对酶解过程产生抑制作用。
２．４金属离子对纤维素酶吸附的影响
纤维素的酶水解是固液非均相反应，纤维素酶首先扩散到底物纤维素的表面被吸附，然后将纤维素水解为可发酵糖［１３］。纤维素酶的吸附存在平衡状态，即吸附达到一定程度后，吸附量达到饱和。研究表明，纤维素酶在纤维上的吸附平衡时间约３０～６０ ｍｉｎ［１４，１５］。因此，纤维素酶对纤维素的可及性是决定水解起始速率的关键因素。为探讨金属离子对纤维素降解的影响机制，比较加入金属离子后对纤维素酶吸附的影响情况。水解过程中反应体系内蛋白质含量测定结果如图５所示。由图５可见，随着纤维素水解反应的进行，水解液中蛋白质含量先增大后逐渐减小，在３０ ｍｉｎ后水解液中蛋白质含量几乎不变。这表明在反应刚开始阶段，由于汽爆秸秆中原含有一定量的蛋白质，随着振荡，这些蛋白质逐渐溶解到反应液中，使得水解液蛋白质含量增加，而之后蛋白质含量又迅速下降，这表明纤维素酶开始吸附到纤维素中，到３０ ｍｉｎ左右达到吸附平衡。添加Fe2+后，加快了纤维素酶的吸附速度，使纤维素酶易于吸附到纤维素中，这也与加入０．６ ｍｇ／ｍＬ Ｆｅ２＋能够提高汽爆秸秆水解率的结果相符，说明Fe2+可以促进底物与酶的结合。
２．５不同水解条件下纤维素结构变化
由以上的研究了解到Ｆｅ２＋对纤维素水解有一定的促进作用。采用有机溶剂处理的方法脱除汽爆秸秆的木质素，然后添加Ｆｅ２＋，发现其水解率可以达到４６．６％。分别将汽爆秸秆、汽爆秸秆添加Ｆｅ２＋和脱木质素的汽爆秸秆添加Ｆｅ２＋水解以后得到的残渣进行红外光谱分析，得到的图谱如图６。图谱Ｂ、Ｃ与Ａ比较可知，３ ３５０ ｃｍ－１、２ ９０６ ｃｍ－１处的振动峰增强，说明有更多的纤维素的β－１，４葡萄糖苷键断裂，降解为还原糖，与水解率研究的结果一致，添加Ｆｅ２＋对于纤维素和脱除木质素的纤维素的水解都有促进作用。不同处理条件下，纤维素样品的红外光谱图相似，只是部分吸收峰的强度发生了变化，证明没有新的化学结构和功能性基团生成，试样的主体化学结构没有明显变化。有文献［１６－１８］表明，纤维素酶的吸附与木质素有关，从红外图谱C上得知，木质素特征吸收峰（1 505 cm-1）减弱较明显，木质素被脱除，但添加Ｆｅ２＋后脱木质素纤维素水解率较之未脱木质素仍有较大幅度提高，其促进作用可能源于金属离子导致纤维素酶蛋白的空间构象变化，从而影响其生物活性。
３结论与讨论
不同金属离子在不同浓度下对汽爆秸秆酶解过程有不同程度的抑制或促进作用。Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋在一定浓度范围内对酶解过程有一定的促进作用，Ｆｅ３＋和Ｍｇ２＋则会抑制纤维素酶解过程。其中，Ｆｅ２＋的促进作用最明显，在ｐＨ ４．５、汽爆秸秆１０ ｇ，酶活性１２ ＦＰＵ／ｇ，Ｆｅ２＋浓度０．６ ｍｇ／ｍＬ的１００ ｍＬ溶液５０ ℃酶解４８ ｈ后，纤维素的水解率比不添加金属离子的提高１８．６０％，采用脱除木质素的汽爆秸秆，其水解率可以达到４６．６％。底物中木质素含量越低，金属离子对纤维素转化率的提高幅度也越大，通过考察添加Ｆｅ２＋后纤维素对纤维素酶吸附的情况以及对水解后纤维素渣的红外光谱分析，表明Ｆｅ２＋能在一定程度上促进纤维素酶与底物纤维素的有效结合，从而对酶解过程起到促进作用。
此次研究了不同金属离子在酶催化反应体系中对纤维素酶活性的影响，其结果与游离酶的影响趋势以及他人的研究结果不尽一致，可能的原因为设定的离子浓度不同或者作为不同来源的纤维素酶激活剂的特定金属离子也不同，因而，同种离子对不同来源的纤维素酶活性的影响以及金属离子对纤维素酶活性影响的机理等尚需进一步研究。
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