陈娟娟１，周延清１，李静云１，张喻１，王婉珅１，范玉霞１，常钊１，岳晓杰１，苑璐璐２
（１．河南师范大学生命科学学院，河南 新乡４５３００７；２．周口市科技局，河南 周口４６６０００）
摘要： 从冷藏的酱鸭中分离筛选乳酸菌，对其进行生理生化特性研究和分子学鉴定。结果表明，从冷藏酱鸭中筛选到２株优良乳酸菌，分别命名为Ｊ１、Ｊ２。结合细菌形态学、生理生化特性和１６Ｓ ｒＤＮＡ序列同源性以及系统进化树分析表明Ｊ１、Ｊ２为副干酪乳杆菌亚种（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．），具有比较好的发酵产酸的能力，并且对大肠杆菌（Ｅscherichia ｃｏｌｉ）和金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）具有很强的抑制作用，能够耐受极端的ｐＨ环境。
关键字：酱鸭；乳酸菌；分离；鉴定
中图分类号：Ｑ９３９．１１+７文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0６７６-0４
乳酸菌是一种常见的益生菌，具有直接为宿主提供营养物质、促进人和动物生长、调节胃肠道及泌尿生殖道的正常菌群、增强机体免疫和维持微生态平衡等多种功能［１］，被广泛应用到医学、食品、饲料工业和环保等方面。乳酸菌在自然界分布广泛，从人体及动物的肠道，到植物、发酵食物、饮料乃至土壤中都存在乳酸菌。曾经有研究者报道过从肠道内容物［２］，发酵的乳制品［３，４］，腌制的泡菜［５，６］，冷藏的鲜肉［７］，发酵的肉制品［８］中分离出各种优质乳酸菌。
肉类中，鸭是一种常见的加工原材料，可以直接或发酵后制成板鸭、卤鸭、酱鸭、虾油鸭等［９，１０］，每一种做法都会赋予其特殊的风味。乳酸菌在发酵的过程中可以产生乙醛和双乙酰等风味物质，从而使发酵制品具有特殊的风味，而发酵的鸭类可能是因为乳酸菌产生了一些风味物质，使其有了独特的风味。林巧［９］从发酵的建昌板鸭中分离到了１７株菌株，通过形态学和生理生化特征进行了鉴定，并从中筛选出了一株耐盐的适合发酵板鸭的菌株。本研究旨在从冷藏的酱鸭中分离乳酸菌，通过形态学、生理生化特征和基因学进行鉴定，再通过发酵产酸试验、低ｐＨ耐受试验、抑菌试验等进一步研究其特性。
１材料与方法
１．１材料
１．１．１样品的采集从河南省新乡市温州酱鸭店购买一只酱鸭，放于无菌的袋子里并放进冰盒内，带回实验室于４ ℃冰箱冷藏保存。
１．１．２培养基ＭＲＳ培养基，明胶液化培养基，葡萄糖产酸培养基，葡萄糖酸盐产酸培养基，脱脂奶粉培养基，按文献［１１］的方法配制。
１．２方法
１．２．１乳酸菌的分离及筛选将放在４ ℃冰箱２周的酱鸭取出，用无菌解剖剪取１ ｇ，并且充分剪碎，加入９ ｍＬ无菌生理盐水中，充分摇匀，然后依次稀释到１０－４、１０－５、１０－６，分别吸取１００ μＬ接种在含１．５％的ＣａＣＯ３的ＭＲＳ平板培养基上，３７ ℃恒温培养箱内培养４８ ｈ。挑取具有透明圈的单菌落划线纯化，连续纯化３次，４ ℃冰箱保存备用。
１．２．２乳酸菌的生理生化鉴定参照文献［１１］，通过革兰氏染色、接触酶反应、运动性试验、明胶液化试验、葡萄糖和葡萄糖酸盐产酸产气试验、甘油发酵试验、Ｄ－山梨醇发酵试验、淀粉发酵试验、蔗糖发酵试验等对分离到的乳酸菌进行初步的鉴定［１１］。
１．２．３乳酸菌的分子鉴定将活化好的菌株利用ＣＴＡＢ的方法提取菌株的总ＤＮＡ，以基因组ＤＮＡ为模版扩增１６Ｓ rRＮＡ。引物是用Ｃｈａｏ等［１２］报道过的引物，２７Ｆ：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ和１５４１Ｒ： ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ扩增其１６Ｓ ｒRＮＡ，引物由华大生物有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为２５ μＬ，其中１０×ＥａｓｙＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ｄＮＴＰｓ ２．５ μＬ， ＥａｓｙＴａｑ ０．２５ μＬ，模版ＤＮＡ １ μＬ，上游引物１ μＬ，下游引物１ μＬ，无菌去离子水１６．７５ μＬ。反应条件：９４ ℃ ３ ｍｉｎ预变性；９４ ℃ ３０ ｓ ，５５ ℃３０ ｓ ，７２ ℃ １ ｍｉｎ，进行３５个循环；最后７２ ℃ 延伸１０ ｍｉｎ；４ ℃保存。用１ ％的琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收１ ５００ ｂｐ左右的片段，用生工生物工程（上海）有限公司的胶回收试剂盒回收，回收产物送到生工生物工程（上海）有限公司进行测序，测序结果在ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行同源性比较，并且用ＭＥＧＡ５．０５建系统进化树做进一步的分析。
１．２．４乳酸菌产酸能力的测定乳酸菌发酵产酸的能力是作为发酵酸奶的优良菌株筛选的重要指标。酸奶的酸度一般以中和100 ｍＬ牛乳所需的０．１ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠的毫升数来表示，称为°Ｔ，此为滴定酸度简称为酸度。将待测菌株接种于ＭＲＳ培养液，３７ ℃恒温培养过夜，活化３代，以充分活化实验菌株。将活化好的菌株按３％的接种量接种于装有１０％脱脂乳培养基的试管中，３７ ℃恒温培养至凝乳，记录凝乳时间。凝乳后置于４ ℃冰箱中后熟２４ ｈ，测定每个管的ｐＨ和滴定酸度。每株３个重复。
ｐＨ的测定用ＰＨＳ－３２０型酸度计测量，测酸度用０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ标准溶液滴定，采用吉尔涅尔度（°Ｔ）表示，按教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献［１３］。具体步骤：量取１０ ｍＬ鲜乳，注入１５０ ｍＬ三角烧瓶内，用２０ ｍＬ中性蒸馏水稀释，加入１％酚酞指示剂５滴，小心混匀，用０．１ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠标准溶液滴定，不断摇动，直至微红色在１ ｍｉｎ不消失为止。将滴定时所耗的０．１ ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠标准溶液的量乘以１０，即为１００ｍＬ酸奶的酸度。
１．２．５乳酸菌耐酸能力的测定［１４］将待测菌株接种于ＭＲＳ培养基中培养４８ ｈ，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４ ℃离心１０ ｍｉｎ。细胞沉淀用ｐＨ ７．０的磷酸盐缓冲液冲洗２次，并悬浮至细胞密度为１×１０１２个／ｍＬ。然后加到ｐＨ为１．０、２．０、３．０的磷酸盐缓冲液中３２ ℃孵育，每１、２、３、４ ｈ取出１００ μＬ接种在ＭＲＳ平板培养基上，同时取１００ μＬ没有经过低ｐＨ磷酸盐缓冲液处理的菌液接种在ＭＲＳ平板培养基上，３４ ℃培养４８ ｈ，最后记录平板上的单菌落个数。乳酸菌的存活率的计算方法是用低ｐＨ处理过的单菌落数除以没有经过处理的单菌落数。
１．２．６乳酸菌的抑菌能力测定［１４］将待测菌株接种在ＭＲＳ液体培养基中活化３代后，取１００ μＬ接种在ＭＲＳ液体培养基中３７ ℃过夜培养，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ ４ ℃离心１０ ｍｉｎ，取上清培养液，调节ｐＨ为５．５（ｐＨ ５．５时抑菌能力最大），用来检测抑菌活性。指示菌株有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。在双层平板上用无菌打孔器打出直径为６ ｍｍ的孔，将１００ μＬ无菌的培养液加入孔内，以不溢出为宜，于４ ℃过夜使加入的培养液充分扩散，３７ ℃培养４８ ｈ。抑菌能力通过测量抑菌圈的直径来表示，单位为ｍｍ。
２结果与分析
２．１菌株的分离筛选结果
从冷藏酱鸭中分离得到表面光滑湿润、边缘整齐、乳白色的菌株共２５株，分别命名为Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、Ｊ４…Ｊ２４、Ｊ２５。其中Ｊ１、Ｊ２的透明圈最大，透明圈越大说明其产酸能力越强，发酵能力就越强。故对Ｊ１、Ｊ２进行了鉴定及性能研究。
２．２菌株的鉴定结果
２．２．１菌落及菌体形态特征鉴定Ｊ１、Ｊ２的菌落及菌体特征见表１。从表１中的菌落形态以及菌体形态可以鉴定这２株菌株为杆菌，并且可以初步鉴定为疑似乳酸菌。
２．２．２生理生化鉴定生理生化鉴定结果如表２，结合菌落和菌体形态，可以初步判断这２株菌株是乳酸杆菌。Ｊ１、Ｊ２均可发酵葡萄糖产酸而不产气，发酵葡萄糖酸盐产酸产气，因此可以判Ｊ１、Ｊ２为兼性异型发酵的乳酸杆菌。
２．２．３１６Ｓ ｒRＮＡ ＰＣＲ扩增产物和测序结果将Ｊ１、Ｊ２用液体培养基活化３次后提取细菌基因组ＤＮＡ，进行１６Ｓ ｒRＮＡ ＰＣＲ扩增、回收、测序，获得长度分别为１ ５１２ ｂｐ和１ ５１６ ｂｐ的碱基序列，将这两个序列在ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行同源性比对发现Ｊ１、Ｊ２与干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌亚种、干酪乳杆菌亚种、玉米乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的同源性都达到了９９％。按照目前通用的分类标准：具有９９％～１００％序列相似性的判定为１个种，具有９７％～９９％序列相似性的判定为１个属，可将Ｊ１、Ｊ２判定为乳杆菌属。下载干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌亚种、玉米乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的１６Ｓ ｒRＮＡ的序列，用ＭＥＧＡ５．０５建系统进化树如图１，从图1中可知，Ｊ１、Ｊ２与副干酪乳杆菌亚种（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ Ｒ０９４， Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ＮＢＲＣ １５９０６）在一个分支上，结合ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ数据库中Ｂｌａｓｔ比对结果，可以将Ｊ１、Ｊ２鉴定为副干酪乳杆菌亚种。
２．３乳酸菌的性能测定结果
２．３．１乳酸菌的产酸能力乳酸菌发酵脱脂奶粉产酸的能力是发酵酸奶优质菌株的重要指标。Ｊ１、Ｊ２乳酸菌的发酵脱脂奶粉产酸结果如表３，从表3可知，这两株菌株发酵酸奶时酸度都比较低，说明其发酵产酸的能力比较强，可能是潜在的优良菌株。
２．３．２乳酸菌的耐酸能力人体胃的ｐＨ介于１．５～２０，因此能够耐受极端的ｐＨ是益生菌的另一个重要特征。图２简单地说明了Ｊ１、Ｊ２在ｐＨ １．０、２．０、３．０的条件下１、２、３、４ ｈ存活率。经过研究发现Ｊ１、Ｊ２在ｐＨ ３．０的条件下，１ ｈ之后的存活率分别为７０％、７６％，４ ｈ之后仍然有存活的菌株，并且在ｐＨ １．０和２．０的条件下，４ ｈ后也仍然有存活菌株，说明Ｊ１、Ｊ２具有一定的耐酸的能力。
２．３．３乳酸菌的抑菌能力经过抑菌试验发现Ｊ１、Ｊ２这两株菌株对大肠杆菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）和金黄色葡萄（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）具有很强的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到了１５ ｍｍ以上，对大肠杆菌的抑菌圈直径甚至达到了３０ ｍｍ以上（表４）。
３小结与讨论
该研究从冷藏酱鸭中分离筛选到的２株菌株经过形态学、生理生化、１６Ｓ ｒRＮＡ序列鉴定为副干酪乳杆菌亚种，分别命名为Ｊ１、Ｊ２。通过对其性能的研究发现Ｊ１、Ｊ２具有很强的发酵产酸和抑菌的能力，并且具备一定的极端ｐＨ环境的耐受能力。另外，陈艳梅［１５］从酸奶中分离到的乳酸菌发酵脱脂奶粉产酸的最低的ｐＨ是４．３５，而Ｊ１、Ｊ２达到了４．３０、４．３６，说明Ｊ１、Ｊ２发酵产酸的能力与用于酸奶发酵菌株的发酵能力不差上下。同时，从抑菌试验结果中可以看出，Ｊ１、Ｊ２具有一定的抑菌能力，尤其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌抑菌圈的直径达到了１５ ｍｍ以上，对大肠杆菌的抑菌圈直径甚至达到了３０ ｍｍ以上。Iyer等［１４］报道过从米糕中分离到的２株抑菌能力强的菌株对大肠杆菌的抑菌圈的直径达到了９ ｍｍ以上，与之相比，Ｊ１、Ｊ２具有更强的抑菌能力。霍小琰等［１６］从酸马奶中分离到了１０株乳酸菌，并做了大肠杆菌的抑菌试验，其中抑菌圈直径最大是１６．３０ ｍｍ，进一步表明乳酸菌Ｊ１、Ｊ２的抑菌能力强。Ｊ１、Ｊ２还具有一定的耐受低ｐＨ的能力，可以在ｐＨ为１、２、３的条件下４ ｈ之后仍能够存活，说明其能耐受低ｐＨ。总的来说，Ｊ１、Ｊ２具有发酵能力强、抑菌能力强、耐酸等特性，是两株优良的乳酸菌。
本研究从冷藏酱鸭中分离筛选到了２株副干酪乳杆菌亚种，其具有很强的发酵产酸、抑菌以及耐酸等能力，是优良的益生菌菌株，可用于发酵制品的研究。另外因Ｊ１、Ｊ２具有很强的抑菌能力，具有保藏酱鸭以及其他储藏食品的潜力。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 张菊，李伟，李金敏，等．乳酸菌制剂的研究现状及在畜牧生产中的应用［Ｊ］．饲料广角，２０１３（５）：２８－３０．
［２］ 张瑞强，王红宁，黄勇，等．牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及ＰＣＲ－１６Ｓ ｒＤＮＡ鉴定［Ｊ］．中国兽医科学，２００６，３６（５）：３８１－３８５．
［３］ ＬＩＵ Ｗ Ｊ， ＢＡＯ Ｑ Ｈ， ＪＩＲＩＭＵＴＵ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ Ｔａｒａｇ ｉｎ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ｏｆ Ｃｈｉｎａ ｂｙ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ＤＧＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１２， １６７（２）：１１０－１１５．
［４］ 李远，巴吐尔，张小燕，等．新疆哈萨克族传统发酵驼乳中乳酸菌的分离鉴定［Ｊ］．中国食物与营养，２０１１，１７（１）：５４－５８．
［５］ ＮＧＵＹＥＮ Ｄ Ｔ Ｌ， ＶＡＮ ＨＯＯＲＤＥ Ｋ， ＣＮＯＣＫＡＥＲＴ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ ｉｎ Ｖｉｅｔｎａｍ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１３， １６３（１）：１９－２７．
［６］ ＪＩ Ｙ， ＫＩＭ Ｈ， ＰＡＲＫ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｋｏｒｅａｎ ｋｉｍｃｈｉ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ２０１３， ３１（２）： ４６７－４７３．
［７］ 董彩文，白燕红，曹高山，等．冷藏鲜肉中腐败乳酸菌的分离及鉴定［Ｊ］．食品研究与开发，２００９，３０（７）：１１７－１２０．
［８］ ＮＧＵＹＥＮ Ｄ Ｔ Ｌ， ＶＡＮ ＨＯＯＲＤＥ Ｋ， ＣＮＯＣＫＡＥＲＴ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｕｌｔｕｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ －ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｍ ｃｈｕａ， ａ Ｖｉｅｔｎａｍｅｓｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍｅａｔ ｐｒｏｄｕｃｔ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ２０１３， ５０（１）： ２３２－２４０．
［９］ 林巧．建昌板鸭中乳酸菌的分离鉴定与特性［Ｊ］．肉类研究，２０１２，２６（３）：９－１２．
［１０］ 施发从．卤鸭、酱鸭、虾油鸭的制法［Ｊ］．四川烹饪，２０１０（３）：４２－４３．
［１１］ 凌代文，东秀珠．乳酸细菌分类鉴定及实验方法［Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９３．
［１２］ ＣＨＡＯ Ｓ Ｈ， ＷＵ Ｒ Ｊ， ＷＡＴＡＮＡＢＥ Ｋ ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｕａｎ－ｔｓａｉ ａｎｄ ｆｕ－ｔｓａｉ， ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｍｕｓｔａｒｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｔａｉｗａｎ［Ｊ］． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９， １３５（３）： ２０３－２１０．
［１３］ 武建新．乳制品加工技术［Ｍ］．北京：中国轻工业版社，２００２．
［１４］ ＩＹＥＲ Ｂ Ｋ， ＳＩＮＧＨＡＬ Ｒ Ｓ， ＡＮＡＮＴＨＡＮＡＲＡＹＡＮ Ｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｄｌｉ ｂａｔｔｅｒ［Ｊ］． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３， ５０（６）：１１１４–１１２１．
［１５］ 陈艳梅．高产酸、耐消化乳酸菌的选育及地黄蓝莓酸奶研发［Ｄ］．河南新乡：河南师范大学，２０１３．
［１６］ 霍小琰，李少英，郭荣荣．酸马奶中乳酸菌的鉴定及生物学特性的研究［Ｊ］．微生物学通报，２０１２，３９（７）：９４０-９４８．