侯金丽１，冯欣２
（１．河南工业贸易职业学院粮食工程系， 郑州４５１１９１；２．天津师范大学生命科学学院／天津市动植物抗性重点实验室，天津３００３８７）
摘要：基于Ｓｒ１８菌代谢产物在２４ ｈ内具有显著的杀线虫活性，为进一步探究其杀线虫机理和作用规律，测定其在１６ ｈ内对线虫应激能力的影响。结果表明，在４ ｈ时处理组对外界条件刺激的敏感性明显提高，运动频率均高于对照组，表明４ ｈ为Ｓｒ１８菌代谢产物对线虫产生作用的转折点；８ ｈ后处理组活跃程度明显减弱，对刺激的反应较对照组缓慢，随着刺激时间增加，处理组的活跃性有所增加但不显著，表明Ｓｒ１８菌代谢产物已产生明显的药效作用，致使线虫对刺激反应迟钝。Ｓｒ１８菌代谢产物对线虫应激能力的影响呈现“平稳－上升－下降”的规律，进一步探究Ｓｒ１８菌代谢产物的作用机理为实践中的合理用药提供理论依据。
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关键词 ：Ｓｒ１８菌代谢产物；线虫；应激能力
中图分类号： ＴＳ２０２．１文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０3－０６０５－０３
植物寄生线虫是一类世界性分布的重要植物病原体，其寄生范围广，不仅对林木的危害十分严重，对全世界农作物的生产也构成了严重威胁。据统计全世界因植物寄生线虫造成的年经济损失占１２．３％［１］，超过１ ０００亿美元，还给人类和动物带来严重的疾病［２－４］。目前应用最广泛的化学药剂已产生环境污染和增加线虫抗药性，使得化学杀线虫药剂的应用受到一定的限制。随着人类环保意识的提高，生物防治成为线虫防治的主导［５］。丝状真菌Ｓｒ１８（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）是从土壤中筛选得到的１株生防菌，其代谢产物在２４ ｈ内具有极强的杀线虫活性［６］。为进一步明确Ｓｒ１８对线虫的毒杀机理，本研究选定松材线虫为试验对象，研究对照组和处理组在１６ ｈ内分别经ｐＨ刺激、温度刺激、机械刺激后线虫平均运动频率的变化，为利用该菌开发微生物源杀线剂奠定理论基础，同时为生物防控线虫危害提供新的途径和技术支撑。
１材料与方法
１．１材料
Ｓｒ１８菌株由天津师范大学生命科学学院提供。在（２７±１） ℃ ＰＳ液体培养基中１２０ ｒ／ｍｉｎ避光振荡培养４ ｄ后，过滤去掉菌体，收集培养液。松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）由中国林业科学院森林保护所提供。松材线虫用以察氏培养基培养的灰葡萄孢菌（Ｂａｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ，ＢＣ菌）避光（２６±１） ℃饲养５~７ ｄ。
１．２方法
１．２．１线虫处理方法用无菌水将线虫稀释为约１５ ０００头／ｍＬ的悬液，每０．２ ｍＬ分装于灭菌的玻璃瓶中，同时加入代谢产物原液２ ｍＬ［７］，分别以处理０、２、４、８、１６ ｈ作为处理组，相应在ＰＳ液体培养基中加入等量的线虫作为对照组，置于（２６±１） ℃培养箱中。
１．２．２Ｓｒ１８菌代谢产物对松材线虫应激能力影响的测定①ｐＨ ２．２刺激条件下的应激变化。分别在设定的时间内取１０条线虫的混合液点于表面皿上，室温２６ ℃，在解剖镜下观察线虫的形态变化和摆动频率，同时用显微成像仪进行记录；然后吸取１５ μＬ ｐＨ ２．２的甘氨酸－盐酸缓冲液缓慢地加到表面皿一侧，观察及记录方法同前。平行测定３次。②ｐＨ １０．０刺激条件下的应激变化。处理时间、观测及记录方法同上，所用缓冲液为ｐＨ １０．０的甘氨酸－氢氧化钠缓冲液。③高温（３８ ℃）刺激条件下的应激变化。分别在设定的时间内取１０条线虫的混合液点于表面皿上，室温２６ ℃，在解剖镜下观察线虫的形态变化和摆动频率，同时用显微成像仪进行记录；然后将该表面皿上的线虫进行３８ ℃高温刺激，刺激时间为７ ｓ，观察及记录方法同前。平行测定３次。④低温（１５ ℃）刺激条件下的应激变化。处理时间、观测及记录方法同高温刺激，所用低温刺激温度为１５ ℃，刺激时间为２０ ｓ。
１．２．３Ｓｒ１８菌代谢产物处理后的松材线虫对机械刺激的应激能力分别在设定的时间内取１０条线虫的混合液点于表面皿上，室温２６ ℃，在解剖镜下用刺针分别刺激不同运动状态的线虫，观察线虫的形态变化和摆动频率，同时用显微成像仪进行记录。平行测定３次。
２结果与分析
２．１Ｓｒ１８菌代谢产物处理后的松材线虫对不同ｐＨ刺激的应激能力变化
如图１所示，在２ ｈ内，对照组和处理组在刺激前后运动频率差别不大。在４ ｈ时，线虫的摆动频率发生了较大变化，处理组比对照组的平均频率高。在ｐＨ ２．２甘氨酸－盐酸缓冲液未刺激时，处理组为２．８７０次／ｓ，对照组为１．５２０次／ｓ。在ｐＨ ２．２甘氨酸－盐酸缓冲液刺激后，平均频率分别为３．７８０次／ｓ和２．５２０次／ｓ，表明处理组在４ ｈ内对外界刺激有了明显的应激反应，即代谢物已产生影响。８ ｈ后，对照组和处理组在刺激前后平均频率差别很大，处理组在刺激前后都比对照组的平均频率低很多。用ｐＨ ２．２甘氨酸－盐酸缓冲液刺激处理组时，线虫反应极其缓慢，而对照组反应灵敏，迅速达到较高频率且持续时间较长。表明线虫的反应灵敏度及运动能力均随着Ｓｒ１８菌代谢产物处理时间的增加呈下降趋势。
如图２所示，在相同处理时间内，对照组和处理组在ｐＨ １０．０刺激前后的运动频率的变化与ｐＨ ２．２刺激相似，表明线虫的反应灵敏度及运动能力均随着Ｓｒ１８菌代谢产物处理时间的增加呈下降趋势。
２．２Ｓｒ１８菌代谢产物处理后的松材线虫对高温和低温刺激的应激能力的变化
由图３可知，高温３８ ℃能够促进线虫的活动。在相同处理时间内，对照组和处理组在３８ ℃高温刺激前后的运动频率的变化与ｐＨ ２．２刺激相似，表明线虫的反应灵敏度与运动能力均随着Ｓｒ１８菌代谢产物处理时间的增加呈下降趋势。
由图４可知，低温１５ ℃能够抑制线虫的活动。在２ ｈ内，对照组和处理组在刺激前后运动频率差别不大。在４ ｈ、15 ℃条件下未刺激处理组线虫的活跃性明显高于对照组，平均频率分别为２．７０0次／ｓ和１．５２０次／ｓ；经１５ ℃低温刺激后，对照组比处理组对低温刺激的反应强烈，对照的线虫运动幅度变小，活动迅速减弱，平均频率分别为０．０６５次／ｓ和０．６３５次／ｓ。８ ｈ后，刺激前后处理组活跃性的变化显著低于对照组。表明线虫的反应灵敏度及运动能力均随着Ｓｒ１８菌代谢产物处理时间的增加呈下降趋势。
２．３Ｓｒ１８菌代谢产物处理后的松材线虫对机械刺激的应激能力的变化
处理组“Ｓ”形运动的线虫经刺激后运动频率加快，但无过激反应；“Ｃ”形运动的线虫经刺激后运动频率加快，部分呈“Ｓ”形曲线；螺旋形等不活跃的线虫经刺激后，２~５ ｓ后才开始有反应，呈伸展趋势，几秒后恢复原状；过度卷曲的线虫受刺激后无明显变化。
３小结与讨论
线虫经Ｓｒ１８菌代谢产物处理后在１６ ｈ内的平均运动频率的变化趋势为先升后降，与未刺激的对照组线虫对比明显不同，表明Ｓｒ１８菌代谢产物具有快速击倒和杀死作用，并显示出药效具有明显的时间效应。
通过对线虫应激能力的观察，在４ ｈ，处理组在刺激后的平均运动频率明显高于对照组，说明处理组在短时间内已受到Ｓｒ１８菌代谢物的影响，对外界刺激的敏感性明显增强，表明４ ｈ为Ｓｒ１８菌代谢产物对线虫产生作用的转折点。８ ｈ后处理组活跃程度明显减弱，线虫的运动方式由头尾反向转变为头尾同向，最后“Ｃ”形或新月形逐渐死亡，对刺激的反应较对照组缓慢，并且随着刺激时间增加，处理组的活跃性虽略有增加，但不显著。表明Ｓｒ１８菌代谢产物有明显的时间效应，药效随时间的延长而增加。
高温和低温条件下由于线虫活跃程度受到抑制，进而影响了药物进入体内和代谢活动，表现为对刺激反应的幅度明显低于对照和ｐＨ刺激，说明药物对线虫的作用程度受到影响，表明药物的作用不具明显的触杀特征，推测该代谢物的杀线虫机理可能为内吸性毒杀。其具体的作用机理还有待进一步的深入研究来证实。
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