张召华１，曾擎屹２，３，林鹏程２，３，赵英２，３
（１．青海省测试计算中心， 西宁８１０0０７； ２．青海民族大学化学与生命科学学院，西宁８１０0０７；３．青藏高原植物化学重点实验室，西宁８１０0０７）
摘要：建立了同时测定藏中当药黄素、当药醇苷、苦龙苷含量的方法。采用反相高效液相色谱法（ＲＰ－ＨＰＬＣ），以Ｋｒｏｍａｓｉｌ－Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）为色谱柱，以甲醇（Ａ）－０．０４％磷酸溶液（Ｂ）为流动相，梯度洗脱，４０％Ａ（０ ｍｉｎ）－６３％Ａ（２０ ｍｉｎ）；流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；柱温为３０ ℃，检测波长为２５４ ｎｍ。结果表明，在２０ ｍｉｎ内完成对３种成分的分析，各成分之间均达到基线分离。当药黄素、当药醇苷、苦龙苷的线性范围分别为：０．６７５ 0～４．０５０ 0 μｇ（Ｒ２＝０．９９９ ５）、０．００５ ５～０．３３０ ０ μｇ（Ｒ２＝０．９９９ ５）、０．０２７ ５～０．１６５ ０ μｇ（Ｒ２＝０．９９９ ５），线性关系良好。平均加样回收率（ｎ＝９）分别为９９．９０％、９９．１５％、９９．８８％。建立的ＨＰＬＣ分析方法简单、准确，能快速测定藏药肋柱花中有效成分的含量。
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关键词 ：ＲＰ－ＨＰＬＣ；药肋柱花（Ｌｏｍａｔｏｇｏｎｉｕｍ ｒｏｔａｔｕｍ（Ｌ．）Ｆｒｉｅｓ ｅｓ Ｎｙｍ）；当药黄素；当药醇苷；苦龙苷
中图分类号：Ｏ６５７．７＋２文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0687-03
肋柱花（Ｌｏｍａｔｏｇｏｎｉｕｍ ｒｏｔａｔｕｍ（Ｌ．）Ｆｒｉｅｓ ｅｓ Ｎｙｍ）是一种传统藏蒙医（蒙药名为哈比日跟—地格达），是龙胆科植物辐花肋柱花的干燥全草。味苦，性寒、钝、糙、轻、燥。用于“协日”热、瘟疫、流感、伤寒、中暑头热、肝胆热、黄疸、胃“协日”、伤热等症状［１，２］。肋柱花为欧亚大陆及北美洲间断分布，全世界已发现的有１８种，其中１６种集中分布在中国西部喜马拉雅山－克什米尔地区，仅两种分布于欧亚大陆及北美，并直达北极地区。在中国分布于黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、陕西、甘肃、新疆、青海等地。生于海拔４ ２００ ｍ以下的山坡，草坡及灌木丛中［３－７］。
当药黄素对四氯化碳引起的转氨酶升高有抑制作用。当药醇苷主要功能是减轻肝细胞的损伤，有效抑制炎症介质（肿瘤坏死因子）的形成，减轻细胞间质的炎性反应，促进受损肝细胞的修复。苦龙苷是龙胆属植物的主要苦味成分，常用作苦味成分［８］。目前有关辐花肋柱花这３种成分检测的文献报道较少［９］；本研究利用ＲＰ－ＨＰＬＣ测定肋柱花中当药黄素、当药醇苷、苦龙苷的含量，对评价药材质量及新药源的研究具有重要意义。
１材料与方法
１．１材料与仪器
１．１．１材料辐花肋柱花由中国科学院西北高原生物研究所胡凤祖教授鉴定并提供，阴干后粉碎过１００目筛，冷藏保存。甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂）；磷酸（分析纯，北京红星化工厂）。当药黄素、当药醇苷、苦龙苷为课题组分离鉴定，纯度大于９８％。
１．１．２仪器Ａｇｉｌｅｎｔ１１００型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），配置手动进样器、在线脱气机、高压二元梯度泵、恒温柱温箱、ＤＡＤ检测器、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００色谱工作站、Ｋｒｏｍａｓｉｌ－Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）色谱柱；ＡＧ２０４型电子分析天平（南京安铎贸易有限责任公司）；ＳＨＢ－Ⅱ型循环水式多用真空泵（上海科兴仪器有限公司）；ＥＹＥＬ４型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）。
１．２试验方法
１．２．１色谱条件色谱柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ－Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）柱；流动相：甲醇和０．０４％磷酸溶液，在０～２０ ｍｉｎ内由４０∶６０至６３∶２７（Ｖ／Ｖ）；流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长为２５４ ｎｍ；柱温为３０ ℃。该色谱条件下当药黄素、当药醇苷、苦龙苷３种成分均被洗脱且达到基线分离，保留时间分别为１０．４０、１４．３０、１５．８６ ｍｉｎ（图１）。
１．２．２对照品溶液的制备精密称取对照品当药黄素０．２７ ｍｇ溶于１ ｍＬ甲醇配成０．２７ ｍｇ／ｍＬ、当药醇苷０．２２ ｍｇ 溶于１ ｍL配成０．２２ ｍｇ／ｍＬ、苦龙苷０．２２ ｍｇ溶于１ ｍＬ甲醇配成０．２２ ｍｇ／ｍＬ，使用时稀释成所需浓度。
１．２．３供试溶液的制备分别精密称取粉碎至１００目的样品０．１ ｇ两份，一份加入甲醇１０ ｍＬ，超声连续提取两次（１．０，０．５ ｈ），合并提取液定容至２５ ｍＬ；另一份加入甲醇１０ ｍＬ，热回流连续提取两次（１．０，０．５ ｈ），合并提取液定容至２５ ｍＬ。过０．４５ μｍ滤膜，在选定色谱条件下测定有效成分的含量。
２结果与分析
２．１线性关系考察
精密量取３种对照品储备液，当药黄素：浓度为０．２７ ｍｇ／ｍＬ的标准品分别以质量为０．６７５、１．３５０、２．０２５、２．７００、３．３７５、４．０５０ μｇ进样。当药醇苷：浓度为０．２２ ｍｇ／ｍＬ稀释至０．０0２ ２ ｍｇ／ｍＬ，分别以质量为０．００５ ５、０．０１１ ０、０．０１６ ５、０．０２７ ５、０．３３０ ０ μｇ进样。苦龙苷： 浓度 ０．２２ ｍｇ／ｍＬ稀释２０倍至０．０１１ ｍｇ／ｍＬ，分别以质量为０．０２７ ５、０．０５５ ０、０．０８２ ５、０．１１０ ０、０．１３８ ０、０．１６５ ０ μｇ进样。以含量（ｘ）为横坐标，峰面积积分值（ｙ）为纵坐标，绘制３个成分的标准曲线，分别求得上述３个组分的回归方程，见表１。
２．２检测限
在选定的色谱条件下，当Ｓ／Ｎ＝３时，对各组分最低检测限进行测定，结果表明，当药黄素、当药醇苷、苦龙苷的最低检测限分别为０．２７、０．４４、０．５０ ｎｇ。
２．３精密度考察
取浓度为０．２７ ｍｇ／ｍＬ当药黄素、０．０１１ ｍｇ／ｍＬ当药醇苷、０．０0２ ２ ｍｇ／ｍＬ苦龙苷混合对照品溶液，在选定的色谱条件下测定色谱峰的峰面积，计算得ＲＳＤ分别为０．７２％、０．９０％、０．９３％（ｎ＝６），表明仪器精密度良好。
２．４稳定性考察
精密称取肋柱花样品０．１ ｇ，按“１．２．３”的方法操作，分别在０、２、４、６、１２、１６ ｈ时分别进样，测定当药黄素、当药醇苷、苦龙苷的峰面积，计算得ＲＳＤ分别为１．４％、１．８％、１．０％（ｎ＝５）。表明样品溶液在１６ ｈ内稳定。
２．５重复性试验
精密称取肋柱花样品０．１ ｇ共６份，按“１．２．３”的方法操作，在选定的色谱条件下测定当药黄素、当药醇苷、苦龙苷的含量，计算得ＲＳＤ分别为２．４％、１．４％、２．０％（ｎ＝６），表明方法重复性良好。
２．６回收率试验
精密称取已测知含量的肋柱花样品０．１ ｇ共９份，分为３组，每组３份，分别添加低、中、高３种浓度的对照品，按“１．２．３”项下操作，测得当药黄素平均回收率为９９．９０％，ＲＳＤ为０．４２％；当药醇苷平均回收率为９９．１５％，ＲＳＤ为０．７３％；苦龙苷平均回收率为９９．８８％，ＲＳＤ为０．１１％，见表２。
２．７样品测定
按“１．２．３”的方法制备的青藏高原辐花肋柱花样品，以“１．２．１”的色谱条件进行分析，以峰面积为标法计算青藏高原辐花肋柱花中当药黄素、当药醇苷、苦龙苷的含量分别为０．０２１ ７、０．０１６ １、０．０４４ ２ ｍｇ／ｇ。
３ 小结与讨论
利用ＤＡＤ检测器在１９０～４００ ｎｍ内扫描３种成分的紫外吸收曲线，吸收曲线显示３种活性成分的甲醇溶液在２５４ ｎｍ波长处有较高的吸收，故确定波长２５４ ｎｍ为检测波长。对不同流速（０．７、０．８、１．０ ｍＬ／ｍｉｎ）及不同柱温（２５、３０、３５、４０ ℃）进行考察，发现柱温３０ ℃、流速在０．８ ｍＬ／ｍｉｎ时３种待测成分均可与其他组分达到基线分离，且分析时间较短。参照文献［１０］，比较了不同提取时间（１５、３０、４５、６０ ｍｉｎ）对提取率的影响，结果发现３０ ｍｉｎ即可将有效成分提取完全。精密称取肋柱花样品０．１ ｇ共８份，每４份为一组，分别用甲醇超声和加热回流处理，测定不同提取次数下上述各有效成分的含量。结果表明，热提取３次以及超声提取２次以后，继续增加提取次数对提取率已无明显影响，但超声次数少，提取率比热回流提取法略高，故本试验采用超声提取法。用甲醇－水、甲醇－０．０４％磷酸水溶液，结果显示甲醇－０．０４％磷酸溶液做流动相时样品中３种成分分离效果及峰形均较好。因此该方法具有提取、分析方法简便、快速、结果准确可靠等特点，对全面评价药物质量及新药的研究有重要的作用。
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参考文献：
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