徐永莉１，覃 强２，张月云１，赵成坚１，谷颖乐１，闫志刚１，李 力１
（１． 广西壮族自治区药用植物园，南宁 ５３００２３；２． 广西中医药大学，南宁 ５３０００１）
摘要：为分析广西褐翅鸦鹃（Ｃｅｎｔｒｏｐｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）的液相指纹特征，建立了样品液相指纹的分析方法。结果表明，通过梯度洗脱，获得了褐翅鸦鹃的１２个液相特征指纹峰，方法学分析结果表明，样品的峰面积和保留时间稳定，该液相方法适用于褐翅鸦鹃的ＨＰＬＣ指纹图谱分析。本方法的建立，将为控制褐翅鸦鹃药材质量提供有效的技术参考。
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关键词 ：褐翅鸦鹃（Ｃｅｎｔｒｏｐｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；高效液相色谱；指纹图谱
中图分类号：Ｏ６５７．７＋２ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）04－0960-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.04.049
收稿日期：２０１４－１１－２９
基金项目：广西卫生厅项目（重２０１２１１８，ＧＺＫＺ１１３２）；广西科技厅项目（桂科重１２１１８００５－２－５）；广西药用植物园青年基金项目（２００８１１）；南宁市科技攻关项目（２０１２３２３８）
作者简介：徐永莉（１９７６－），女，山西太原人，助理研究员，从事药用动物繁育与选育方面的研究，（电话）１３４５７０６８９０７（电子信箱）ｘｙｌｙｚｇ７８９８＠１２６．ｃｏｍ；
通信作者，李 力，研究员，从事药用动物资源利用与保护研究，（电话）０７７１－２４４３０２５（电子信箱）ｌｉｂｏｓｈｉ１９６３＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ。
褐翅鸦鹃（Ｃｅｎｔｒｏｐｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）别名绿结鸡、毛鸡、落谷等，属鸟纲、鹃形目、鸦鹃科、鸦鹃属，为国家二级保护动物［１］，是著名观赏及药用鸟类，分布于印度、中国、东南亚、菲律宾等国家和地区，中国主要分布于长江流域以南的浙江、福建、广东等地区。褐翅鸦鹃味甘，性温，《广西中药志》记载内用妇科调经、补血，外用跌打、风湿。由于该资源匮乏，在药用市场充斥大量伪品，而相关鉴定研究严重滞后，为了实现药用资源的可持续发展，利用先进的分析技术建立科学的鉴别方法显得尤为重要。中药指纹图谱是近些年迅速发展起来的一种中药质量控制方法，具有系统性、整体性和稳定性等特点［２］。采用高效液相色谱法进行褐翅鸦鹃的指纹图谱研究，将为褐翅鸦鹃药材质量控制提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
褐翅鸦鹃药材于广西各地收集，产地和采收时间见表１。所采样品经广西壮族自治区药用动物研究室研究员李力鉴定均为褐翅鸦鹃。
１．２ 仪器与试剂
２４０高效液相色谱仪，配高压四元梯度泵、标准自动进样器、二极管阵列检测器（美国Ｖａｒｉａｎ公司）；Ｄ８２７ＭＨ２Ｘ色谱工作站（美国Ｖａｒｉａｎ公司）；ＬＧ１６－Ｗ高速微量离心机（美国医用离心机厂）；ＫＱ２２００Ｅ型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ａｃａｄｅｍｉｃ超纯水器（美国密理博公司）；ＣＰ２２４５电子分析天平（德国赛多利斯）。
甲醇、乙腈（色谱纯）购于天津市四友精细化学品有限公司，乙醇（分析纯）购于天津市福晨化学试剂厂。
１．３ 方法
１．３．１ 色谱条件 色谱柱Ｐｈｅｎｏｘｍｅｎｅｘ Ｓｙｅｒｇｉｃ Ｈｙｄｒｏ－Ｃ１８（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，４ μｍ），流动相洗脱程序见表２，柱温２５ ℃，检测波长２３０ ｎｍ，进样量１０ μＬ，流速１ ｍＬ／ｍｉｎ。
１．３．２ 供试品溶液制备 褐翅鸦鹃去头、爪、毛、内脏，置烘箱内６０ ℃烘干，粉碎，称取粉末约１ ｇ，过６０目筛，称取一定样品，准确加入９５%乙醇（V／V，下同）１５ ｍＬ，超声４０ ｍｉｎ，过滤，滤渣加入９５%乙醇１５ ｍＬ，超声３０ ｍｉｎ，过滤，合并提取液，将提取液减压浓缩，用甲醇定容至１０ ｍＬ，摇匀，０．４５ μｍ滤膜过滤，置于４ ℃冰箱中备用。
１．３．３ 方法学试验 取褐翅鸦鹃的供试品，按“１．３．２”前处理，采用“１．３．１”色谱条件，分别在０、４、８、１２、１６、２４ ｈ检测指纹图谱，测定峰面积，计算其稳定性。取褐翅鸦鹃的供试品，连续进样６次，测定峰面积，检测仪器精密度。称取褐翅鸦鹃粉末（批号：２０１１０２）５份，记录指纹图谱，测定峰面积，计算其重复性。
２ 结果与分析
２．１ 方法评价
稳定性试验结果表明，不同时间下各色谱峰的相对保留时间（ＲＳＤ为０．２９％～２．０７％）和占总峰面５％以上各峰相对峰面积（ＲＳＤ为１．１５％～２．７９％）数值基本一致，可见样品溶液在２４ ｈ内稳定性良好。精密度试验结果表明，各色谱峰的相对保留时间（ＲＳＤ为０．２５％～１．４８％）和各峰相对峰面积（ＲＳＤ为１．０５％～２．６９％）数值基本一致，可见仪器的精密度良好。重现性试验结果表明，５份样品的ＨＰＬＣ指纹图谱中各色谱峰相对保留时间（ＲＳＤ为０．３９％～２．３３％）和各峰相对峰面积（ＲＳＤ为１．６２％～２．９４％）数值基本一致，可见试验方法的重复性良好。
２．２ 样品测定
褐翅鸦鹃的ＨＰＬＣ色谱图如图１所示，１０批褐翅鸦鹃供试品ＨＰＬＣ叠加色谱图如图２所示。由色谱中各指纹峰的面积，即可构建样品的ＨＰＬＣ指纹谱。
《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》规定［３－５］，必须根据１０批或１０批以上供试品的检验结果，采用相对保留时间标定共有指纹峰。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统Ａ版》计算机软件对指纹图谱数据分析［６－８］，１０批次图谱都匹配的色谱峰标定为共有指纹图谱。本试验共标定有１２个共有指纹峰，结果见图２。相似度软件设置，以中位数法作为生成对照指纹图谱的方法，设定时间窗宽度为１．０ ｍｉｎ，软件自动匹配图谱，系统依据褐翅鸦鹃的共有模式，生成对照指纹图谱，结果见图３。
峰面积占总峰面积５％以上的共有峰有：１号峰、２号峰、５号峰、６号峰，本试验选定以指纹图谱中保留时间相对适中的６号峰作为参照峰，以参照峰的保留时间和峰面积作为１，分别计算共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果１０批样品共有峰相对保留时间ＲＳＤ小于３％，相对峰面积ＲＳＤ为３５％左右。
３ 讨论
预试验中比较了冷浸提取、超声提取和回流提取３种制备方法，结果发现超声提取效果较好，色谱峰较多，重复性较好；分别采用了甲醇－醋酸、乙腈－醋酸、乙腈－水等不同比例的流动相进行梯度洗脱，结果发现乙腈－水系统按方法中所述的梯度是最佳方案，可使样品中的吸收峰得到较好的分离，满足测试的需要。
褐翅鸦鹃的乙醇提取液中所含物质种类繁多，在某一特定色谱条件下，不可能使所有的吸收峰都得到良好分离。尽管在样品洗脱初始阶段吸收峰的分离状况不甚理想，峰的重叠较为严重，但洗脱过程中所获得的色谱数据的稳定性良好，可以满足作为指纹图谱的需要。指纹图谱的评价指标是指供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱（共有模式）及供试品之间指纹图谱的相似性。相似性可以用“相似度”表达，相似度可以借助国家药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”来计算，除个别品种视具体情况而定外，一般指纹图谱相似度计算结果应在０．９～１．０之间。本试验采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统Ａ版》进行褐翅鸦鹃ＨＰＬＣ指纹图谱相似度计算，１０批次不同产地褐翅鸦鹃样品的ＨＰＬＣ指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果均大于０．９，表明各批次褐翅鸦鹃与对照指纹图谱有较好的一致性。
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参考文献：
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［３］ 国家药品监督管理局．中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）［Ｊ］．中成药，２０００，２２（１０）：６７１－６７５．
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（责任编辑 周有祥）