李丽君，陈思礼，马凯，蒋泽凤，周江旭
（中南民族大学生命科学学院，武汉４３００７４）
摘要：为研究鱼腥藻PCC7120（Ａnabaena sp.）基因ａｓｒ０７５７／ａｌｒ０７５８在毒素－抗毒素系统中的相关生物学功能，设计了特异性引物，扩增目的片段ａｓｒ０７５７和ａｌｒ０７５８，将目的基因与ｐＭＤ１８－Ｔ载体连接构建克隆载体，并对其进行ＸｈｏⅠ和ＮｄｅⅠ双酶切，再与表达载体ｐＥＴ－２８ａ连接构建表达重组菌，重组菌的体外表达在ＩＰＴＧ的诱导下进行。经琼脂糖电泳检测，结果扩增出了大小为２１０ ｂｐ的ａｓｒ０７５７和３４２ ｂｐ的ａｌｒ０７５８目的基因。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，表达出相对分子质量分别为８．０６８ ｋＤ和１２．５３４ ｋＤ的蛋白质。根据结果可初步认定ａｌｒ０７５８为毒素基因，ａｓｒ０７５７为抗毒素基因，共同构成鱼腥藻PCC7120毒素－抗毒素系统。
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关键词 ：鱼腥藻ＰＣＣ７１２０（Ａnabaena sp.）；毒素－抗毒素系统；ａｓｒ０７５７/alr０７５８
中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０３－０７０９－０４
鱼腥藻ＰＣＣ７１２０的毒素－抗毒素（Ｔｏｘｉｎ－ａｎｔｉｔｏｘｉｎ，ＴＡ）系统是由编码毒素蛋白和抗毒素蛋白的２个基因对共同组成的，毒素蛋白可通过影响细胞的相关生物学功能使其死亡，同时毒素也可能对人类及其他生物体造成威胁［１－４］。研究表明，根据ＴＡ系统编码产物的序列相似性可将其分为ｒｅｌＢＥ、ｍａｚＥＦ等８个系统家族，且大肠杆菌染色体上的ｍａｚＥＦ家族是目前研究最广、遗传背景相对清楚的ＴＡ系统之一［５，６］。本试验通过分子生物学分析，对鱼腥藻ＰＣＣ７１２０基因ａｓｒ０７５７／ａｌｒ０７５８进行了相关研究，旨在为该基因在毒素－抗毒素系统中的相关生物学功能的研究提供基础，为治理水华污染和开发高效的蛋白表达系统提供新思路。
１材料与方法
１．１试验材料
１．１．１藻种藻种为鱼腥藻ＰＣＣ７１２０（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ． ＰＣＣ７１２０），由中南民族大学生命科学学院病原分子生物学研究室保存（购于中国科学院水生生物研究所）。
１．１．２主要试剂及仪器克隆载体ｐＭＤ－１８Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶（Ｔａｋａｒａ公司），ＤＮＡ聚合酶（Fermentas公司），琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒ＤＮＡ提取试剂盒（Ａｘｙｇｅｎｅ公司），Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、表达载体ｐＥＴ－２８ａ为本实验室保存，ＰＣＲ引物合成、克隆载体及表达载体的测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
ＨＺＱ－Ｃ型空气浴振荡器（哈尔滨市东明医疗仪器厂）、ＫＤＣ－１６Ｈ型高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）、ＴＧＬ－１６Ｂ型台式高速离心机（湖南星科科学仪器有限公司）、ＳＷ－ＣＪ－２ＦＤ型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、ＤＹＹ１１Ｂ型三恒电泳仪（上海金鹏分析仪器有限公司）。
１．２试验方法
１．２．１引物设计与合成以及目的基因ＰＣＲ为扩增目的基因ａｓｒ０７５７及ａｌｒ０７５８，先通过ＮＣＢＩ找到鱼腥藻ＰＣＣ７１２０的已知基因序列，再利用Ｏｌｉｇｏ ７．０软件设计４条引物：ａｓｒ０７５７－Ｆ（５′－ＣＣ
ＣＡＧＡＣＴＧＡＴＡＡＣＡＴＡＣ－ ３′）、ａｓｒ０７５７－Ｒ（５′－ＣＣＧ
ＴＡＡＴＴＴＧＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＧＴＣ－３′）、ａｌｒ０７５８－Ｆ（５′－ＣＣ
ＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＡＴＴＣＧＧＧＧＡＴＧＴＴＡＴＣ－３′）、ａｌｒ０７５８－Ｒ（５′－ＣＣＧ
ＧＣＣＣＧＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＡＡＣ－３′）。下划线部分为酶切位点序列，其中“ＣＡＴＡＴＧ”对应ＮｄｅⅠ、“ＣＴＣＧＡＧ” 对应ＸｈｏⅠ。通过降落式ＰＣＲ技术得到大量目的片段，并用ＤＮＡ回收试剂盒对目的片段进行纯化回收，为后续试验做准备。
ａｓｒ０７５７／ａｌｒ０７５８ ＰＣＲ程序：９４ ℃ ４ ｍｉｎ，１个循环；９４ ℃ １ ｍｉｎ，５５．５ ℃（０．５↓） ／６５．５ ℃（０．５↓） １ ｍｉｎ，７２ ℃ ４０ ｓ，１５个循环；９４ ℃ １ ｍｉｎ，４８ ℃／５８ ℃ １ ｍｉｎ，７２ ℃ ４０ ｓ，２５个循环；７２ ℃ ７ ｍｉｎ，１个循环。
１．２．２重组克隆载体的构建ＰＣＲ扩增目的片段通过ｐＭＤ－１８Ｔ Vｅｃｔｏｒ转化到ＣａＣｌ２法制备的Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞中，并通过蓝白斑筛选在氨苄青霉素抗性固体培养基上进行双重阳性筛选，最终挑取白色菌斑进行菌落ＰＣＲ，通过测序比对，从而确定克隆载体构建成功与否。Ｔ－Ａ克隆体系为０．５ μＬ Ｔ载体、３．０ μＬ ＰＣＲ纯化产物、１．５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、５．０ μＬ溶液Ⅰ。
１．２．３重组表达载体的构建用ＸｈｏⅠ和ＮｄｅⅠ对重组质粒进行双酶切获取目的基因片段，双酶切体系见表１。通过Ｔ４ DNA连接酶将目的片段与表达载体ｐＥＴ－２８ａ相连，连接体系见表２。将连接产物转化入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１中，使其在含卡那霉素抗性的固体培养上培养，进行阳性筛选。有菌落白斑长出后，挑菌摇床过夜并取适量菌液测序以确定表达载体是否构建成功。
１．２．４毒素－抗毒素蛋白质的诱导表达将含有重组质粒的菌液接种于新鲜的含５０ μｇ／ｍＬ抗生素（卡那霉素）的ＬＢ抗性液体培养基中，３７ ℃摇床过夜，再取５０ μＬ菌液活化３ ｈ，而后加入ＩＰＴＧ摇床１２ ｈ诱导蛋白质表达。对样品进行处理后，用１５％分离胶和５％的浓缩胶进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测蛋白质表达的相对分子质量。
２结果与分析
２．１ａｓｒ０７５７／ａｌｒ０７５８基因的扩增
应用ＰＣＲ扩增技术扩增ａｓｒ０７５７／ａｌｒ0７５８基因，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，基因片段的实际大小与预期大小（２１０ ｂｐ和３４２ ｂｐ）相符（图１、图２）。
２．２克隆载体的构建
ＰＣＲ扩增后的目的片段通过与ｐＭＤ１８－Ｔ载体在４ ℃条件下连接过夜，将连接产物转化到用ＣａＣｌ２法制备的Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，挑取阳性单菌落进行菌落ＰＣＲ检测，将菌液进行测序，结果表明２个目的基因ａｓｒ０７５７、ａｌｒ０７５８均成功转入（图３）。
２．３表达载体的构建
选取ｐＥＴ－２８ａ上的酶切位点ＸｈｏⅠ和ＮｄｅⅠ，对克隆重组质粒进行双酶切，并将回收后的目的基因片段连接到表达载体ｐＥＴ－２８ａ上，再转化到大肠杆菌ＢＬ２１细胞中，挑取阳性单菌落，进行质粒提取及双酶切检测，通过初步鉴定后进行测序。结果表明，表达载体成功构建（图４、图５）。
由图４可知，在ａｓｒ０７５７基因表达菌序列比对结果中，配对率为１００％，基因覆盖率为９８％。图５为ａｌｒ０７５８基因表达菌序列比对结果，结果表明其配对率为１００％，基因覆盖率为９９％。２个基因引物设计时，均敲除了终止密码子。
２．４毒素－抗毒素蛋白质的诱导表达
经测序成功的表达载体重组质粒，在ＩＰＴＧ的诱导下进行体外表达（图６）。结果表明，毒素－抗毒素蛋白质在３７ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ的条件下经ＩＰＴＧ诱导１２ ｈ时有蛋白质表达，但ａｌｒ０７５８基因表达量较少，且诱导剂本身对细胞生长有一定的毒性作用，所以初步认为其为毒素基因。目的毒素蛋白质、抗毒素蛋白质相对分子质量分别为８．０６８ ｋＤ和１２．５３４ ｋＤ，再加上其组氨酸标记及相应的酶切位点，分子量增加约为５ ｋＤ，故实际检测到的蛋白质相对分子质量约１３．０６８ ｋＤ和１７．５３４ ｋＤ。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，在１０～１５ kＤ之间及１５～２０ ｋＤ之间分别有一较为明显的条带，与理论值基本相符。
３讨论
本试验设计了ａｓｒ０７５７和ａｌｒ０７５８基因的特异性引物，采用降落ＰＣＲ扩增目的基因构建相应的克隆载体，再利用经测序检测正确的克隆重组质粒来构建表达载体，测序并进行序列比对后表明，目的基因均正确插入到表达载体ｐＥＴ－２８ａ中，且没有任何碱基突变出现，故２个目的基因表达载体均成功构建。在表达载体的构建过程中，载体与目的片段的最佳浓度比例为１∶６～１∶９，此比例下菌落生长状况较好。大于１∶６的比例时，菌落几乎不生长，故载体与目的片段比例的选取是该步骤中的一个重要因素。此外，正常生长的单菌落中，由于载体未完全切开或载体自连等原因产生假阳性，因此必须对重组质粒进行测序以验证试验结果。
含目的基因ａｓｒ０７５７的ｐＥＴ－２８ａ－ａｓｒ０７５７和含目的基因ａｌｒ０７５８的ｐＥＴ－２８ａ－ａｌｒ０７５８经ＩＰＴＧ诱导表达，经ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ软件分析可知，蛋白质表达的大小分别为８．０６８ ｋＤ和１２．５３４ ｋＤ，再加上５ kＤ左右的组氨酸标记及相应酶切位点，理论大小为１３．０６８ ｋＤ和１７．５３４ ｋＤ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明，目的蛋白质的分子实际大小与理论值基本相符。目的蛋白质在３７ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ条件下培养表达，但其最佳表达条件有待进一步研究。毒素基因ａｌｒ０７５８可能具有核酸酶活性，而已有的研究表明，具有核酸酶活性的毒素蛋白质可通过降解ｍＲＮＡ抑制细胞生长［７－１０］，故其表达量较少。
目前，淡水湖泊的污染形势日趋严峻，而藻类是水体富营养化的主要媒介，且大肠杆菌细胞染色体上ＴＡ系统基因参与了一种特殊的环境胁迫应答并介导细菌的程序性死亡［１１，１２］，使得对ＴＡ系统的研究具有十分重要的指导意义。本试验成功克隆和表达了鱼腥藻ＰＣＣ７１２０染色体基因ａｓｒ０７５７和ａｌｒ０７５８，并对其相关性质进行了初步研究，为后续的相关试验奠定基础。
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