蔡海亚１，徐得泽１，Ｅｌａｇｉｂ T２，Ｓａａｄ S２，姜 乐3，闸雯俊１，李三和１，
刘 凯１，游艾青１，焦春海4
（１．湖北省农业科学院粮食作物研究所／粮食作物种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，武汉 ４３００６４；２．苏丹农业科学院，苏丹 喀土穆 ９９９１２９；3.湖北省武昌实验中学，武汉 430060；4.湖北省农业科学院，武汉 ４３００６４）
摘要：为了评价湖北省及部分其他地区审定的具有代表性杂交稻骨干亲本遗传相似性并构建其指纹图谱，利用４８个ＳＳＲ分子标记对来自湖北及部分其他省份的１９份材料进行分析，结果共检测到６２个等位基因，平均每个ＳＳＲ标记检测到３．８８个，变幅为２～７个；每个标记的多态性信息含量（ＰＩＣ）平均值为０．５０１，变幅为０．２６６～０．７９２，选取ＰＩＣ最高的１１个作为核心标记构建完成１９份材料的指纹图谱；ＳＳＲ聚类分析结果表明，恢复系和不育系的遗传基础均较狭窄，表现出较高的平均遗传相似系数（分别为０．７７１与０．７０７），但恢复系和不育系之间的遗传距离相对较远，从一定程度上反映了遗传距离与杂种优势的正相关性。
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关键词 ：水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）；指纹图谱；遗传多样性
中图分类号：Ｓ５１１； Ｓ３３６ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）04－0984-04
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．2015.04.０56
收稿日期：２０１４－０９－１６
基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（３１３０１２８８）；国家国际科技合作专项（２０１１ＤＦＢ３１６２０）；国家“９７３”计划项目（２０１３ＣＢＡ０１４０５）；中苏农作物种质资源联合技术研究与示范项目
作者简介：蔡海亚（１９７９－），男，山东济宁人，助理研究员，博士，主要从事水稻分子育种，（电话）１３４７６２８１１１５（电子信箱）ｙｔｃｈｙ＠１２６．ｃｏｍ；
通信作者，游艾青，研究员，博士，主要从事水稻育种工作，（电子信箱）ｙｏｕａｉｑｉｎｇ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ；焦春海，研究员，主要从事农业科技管理和品种资源研究工作，（电子信箱）ｊｉａｏｃｈ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。
随着世界人口的增加和耕地面积的减少，粮食短缺成为日益突出的问题。然而，近年来水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）产量基本处于徘徊状态，究其原因主要是亲本来源单一及优异亲本的重复使用导致栽培稻遗传基础日益狭窄，水稻产量潜力及抵抗各种逆境的能力受到影响［１，２］。另外，近年来参加区试新品种每年呈递增趋势，但传统的水稻新品种特异性、一致性和稳定性（ＤＵＳ）的测试存在鉴定周期长、鉴定结果易受环境影响等局限性，给新品种的鉴定和市场监管带来很大麻烦，利用ＳＳＲ构建指纹图谱能快速、准确地鉴定品种，为作物育种和种子管理提供了极大的便利［３－５］，同时ＳＳＲ标记还广泛应用于遗传多样性分析［６，７］，两者相结合有效地加快水稻新品种选育与审定的进程。
本研究以湖北省及部分其他地区审定的优异杂交稻骨干亲本及部分常规稻共１９份材料为研究对象，利用ＳＳＲ分子标记进行了ＤＮＡ指纹图谱的构建，并利用聚类分析研究了它们的遗传关系，旨在为这些优异水稻资源的种质鉴定和创新利用提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
本试验选取了湖北省近几年审定的具有代表性的杂交中稻亲本，如超级稻品种广两优２７２（父本：Ｒ２７２；母本：广占６３Ｓ）、培两优３０７６（父本：Ｒ３０７６；母本：培矮６４Ｓ），湖北省单一品种权转让金额最高的广两优５号（父本：香５；母本：广占６３Ｓ）等代表性品种。同时还选取了其他地区选育的代表性品种，如审定次数最多的几个品种黄华占（常规稻）、扬两优６号（父本：扬稻６号；母本：广占６３Ｓ）、两优培九（父本：扬稻６号；母本：培矮６４Ｓ），推广面积最大的汕优６３（父本：明恢６３；母本：珍汕９７Ａ）、桂朝２号（常规稻）等；另外还加入了水稻中第一个完成全基因组测序的粳稻品种日本晴作为对照构建它们的指纹图谱并分析遗传相似性（表１）。
１．２ ＤＮＡ提取与ＰＣＲ扩增
于苗期取供试材料叶片，按照ＣＴＡＢ方法提取ＤＮＡ［８］，选取具有良好多态性的国标中已经公布的４８对水稻ＳＳＲ引物［９］，筛选出在本试验材料中多态性好、扩增稳定、杂带少的引物作为构建指纹图谱及遗传多样性分析的核心引物。ＰＣＲ反应体系为２０ μＬ，包括２．０ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，１．０ μＬ ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），上、下游引物（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）各０．５ μＬ，０．２ μＬ Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ），２．０ μＬ模板ＤＮＡ，１３．８ μＬ ｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５５ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸４５ ｓ，共３５个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用６％ SDS-ＰＡＧＥ胶分离。
１．３ 数据分析
以０、１统计ＳＳＲ扩增带型，在相同迁移率位置上，有带记为１，无带记为０。等位基因位点数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅ，Ｎａ）为群体内等位变异的总数；有效等位基因位点数（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅ， Ｎｅ），Ｎｅ=1/∑（pi）2；多态性信息量（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｄｅｘ ｃｏｎｔｅｎｔｓ，ＰＩＣ），ＰＩＣ=1－∑（pi）2；式中Ｐｉ为第ｉ个多态位点上的基因频率。采用统计分析软件ＮＴｓｙｓ ２．１对１９份材料的遗传相似性进行分析，计算任意两个品种间的遗传相似系数，根据遗传相似系数按非加权类平均法（Ｕｎ－ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎｓ， ＵＰＧＭＡ）进行聚类分析。
２ 结果与分析
２．１ ＳＳＲ标记的多态性分析
从已公布具有良好多态性的４８对国标引物中筛选出１６对稳定性好、多态性高、杂带少且在染色体上均匀分布的ＳＳＲ引物，如表２所示。这些标记在１９份供试材料中共检测到６２个等位基因，每个标记平均３．８８个，变幅为２～７个，其中ＲＭ３１１检测到的等位基因数最多，为７个，其次是ＲＭ２２４与ＲＭ２０８，均为６个，ＲＭ５６７与ＲＭ２７４最少均为２个；１６个ＳＳＲ标记检测到的有效等位基因数平均值为２．３８２个，变幅为１．３６２～４．８１３，较高为ＲＭ３１１、ＲＭ２０８和ＲＭ２２４。每个标记的多态性信息含量（ＰＩＣ）平均值为０．５０１，变幅为０．２６６～０．７９２，较高同样为ＲＭ３１１、ＲＭ２０８和ＲＭ２２４（图2）。综上所述，ＲＭ３１１、ＲＭ２０８和ＲＭ２２４是评价不同来源水稻品种遗传相似性比较理想的ＳＳＲ标记。
２．２ ＳＳＲ标记的聚类分析
基于１６个ＳＳＲ分子标记１９份材料的聚类结果表明（图１），在遗传相似系数０．５６处供试材料分为籼稻和粳稻两个大亚类群，分别对应类群Ｉ与类群ＩＩ，而籼亚群中在遗传相似系数０．７５处分为５个类群，其中恢复系根据不同来源又被分在不同类群中：首先以中国应用面积最广的恢复系扬稻６号为基础选育而来的品种Ｒ４７６与Ｒ２７２均表现出与扬稻６号较高的遗传相似性（遗传相似系数分别为１.00和０．９４）被归为第一类群；其次是来源于中国香稻的恢复系香５和华占被归为第二类群，两者与中国香稻的遗传相似系数分别为０．８７与０．８１；最后是来源于圭６３０的明恢６３和蜀恢５２７以及由明恢６３选育出的Ｒ１１２８均表现出较高遗传相似性被归为第四类群；不育系的选育根据其来源也归为了几个不同类群，应用面积最广的不育系珍汕９７Ａ处于第一类群，而新安Ｓ由广占６３Ｓ选育而来因此表现出较高的遗传相似系数（０．９４）归为第二类群；Ｙ５８Ｓ的亲本之一为培矮６４Ｓ（０．８４）两者归为第五类群。另外，Ｒ３０７６也是由扬稻６号选育而来，但是却表现出与之相对较远的亲缘关系（遗传相似系数０．７４），单独归为第三类群，这或许是育种中人工选择的结果；另外，常规稻桂朝２号被划为第一类群，黄华占被划为第四类群，而鄂中５号被划为第五类群。
２．３ 指纹图谱的构建
从１６个多态性ＳＳＲ分子标记中选择多态性信息含量最高的１１个作为核心引物建立了１９份材料的ＤＮＡ指纹图谱（表３），在相同的迁移位置上用数字“１”和“０”代表扩增条带的有无，从而获得了各品种由４８位数字组成的“分子身份证”，除了材料１（扬稻６号）和材料４（Ｒ４７６）外每个品种获得的图谱都不尽相同，从而可以将这些材料区分开来，如香５（品种５）的ＤＮＡ分子身份证为００１００００１０００
０１０１００１００１０１０００１００００００００１０００１００００１０００，利用ＲＭ３１１和ＲＭ２２４就可以将它和其余品种区分开来，其特征谱带分别为０１０００００与０００１００。
３ 小结与讨论
本研究利用１６个ＳＳＲ分子标记构建了来自湖北省及其他地区的１９个高产优质稻品种的指纹图谱，同时研究了它们的遗传关系。结果表明，恢复系和不育系都表现出了来源于几个优异亲本的类群，遗传基础相对狭窄，但不育系平均遗传相似系数显著性小于恢复系（分别为０．７０７与０．７７１，Ｐ＜０．０５）。另外，不育系与恢复系之间的遗传相似性（平均值０．７１２）极显著小于恢复系之间的遗传相似性（Ｐ＜０．０１），比如汕优６３两亲本遗传相似系数为０．６８，两优培九为０．６３，扬两优６号为０．６８，湖北省审定的培两优３０７６与广两优２７２分别为０．６３与０．６５，广两优４７６与广两优香５分别为０．６８与０．８１，因此，杂交稻组合的两亲本之间表现出相对较远的亲缘关系，这在一定程度上说明品种间遗传差异是形成杂种优势的基础。通过了解本研究中水稻品种遗传关系可以辅助杂交育种中的亲本选配，从而扩大栽培稻遗传基础，充分利用杂种优势提高水稻产量。
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（责任编辑 屠 晶）