李晓丹，赖鹤鋆，林婉琪，李璇君，林雅玲
（韩山师范学院化学系，广东 潮州５２１０４１）
摘要：采用传统酸碱法提取潮汕地区虾蟹壳中甲壳素，对HCl溶液浓度、HCl溶液用量、酸浸时间３个因素进行正交试验，确定虾壳中脱钙的最佳工艺为提取５．００ ｇ虾壳需HCl溶液浓度１．５０ ｍｏｌ／Ｌ，酸浸时间６ ｈ，HCl溶液用量５０．００ ｍＬ，氢氧化钠溶液浓度为２．００％，碱浸时间２４ ｈ时，平氢氧化钠溶液用量３６．３０ ｍＬ，甲壳素含量为２２．４０％；蟹壳中脱钙的最佳工艺为５．００ ｇ蟹壳需HCl溶液浓度１．５０ ｍｏｌ／Ｌ，酸浸时间６ ｈ，HCl溶液用量７５．００ ｍＬ，氢氧化钠溶液浓度２．００％，碱浸时间２４ ｈ，平均氢氧化钠溶液用量２５．０３ ｍＬ，甲壳素含量为１９．８０％。
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关键词 ：虾蟹壳；甲壳素；脱钙；脱蛋白
中图分类号：ＴＳ２０２．３文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0６６８-03
甲壳素又名甲壳质、几丁质，化学名称为（１，４）－２－乙酰氨基－２－脱氧－Ｄ－葡萄糖［１］，是自然界大量存在的惟一的天然碱性多糖。甲壳素和其衍生物壳聚糖被誉为继蛋白质、糖、脂肪、维生素、矿物质以外的第六生命要素［２］。目前，由于甲壳素易进行化学修饰，经化学修饰后的产品已在医药、食品、卫生、轻纺、环保等领域得到广泛应用［３］。所以从低值海洋生物及下脚料中获取相对高价值的活性物质，作为功能性食品或者药品成分，安全性高，且具有显著的社会效益、经济效益和环境效益［４］。
甲壳素广泛存在于海洋甲壳动物外壳、软体动物内骨骼、昆虫翅膀、菌类及藻类细胞壁内［５］。而广东潮汕地区濒临海洋，具有丰富的海洋生物资源，尤其是虾蟹等甲壳类生物。但这些虾蟹加工后产生的外壳常被当作废弃物处理，不仅浪费，而且造成了环境污染。本试验研究了采用酸碱法从虾蟹壳中制取甲壳素的最佳投料比，并分别测定虾与蟹壳中的钙含量和蛋白质含量，为未来我国甲壳素新材料的深入研究和应用奠定基础。
１材料与方法
１．１试验材料
原料：虾、蟹壳（购自潮州市海鲜城）。
试剂：盐酸、氢氧化钠、乙二胺二乙酸钠、甲基橙试剂、碳酸钙等，均为分析纯。
仪器：ＪＺ７１２２型粉碎机，购自上海嘉定粮油仪器有限公司；ＦＡ２００４Ｎ型电子天平，购自上海精密科学仪器有限公司；ＤＧＧ－９２４０Ｂ型电热恒温鼓风干燥箱，购自上海森信实验仪器有限公司；ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１型傅立叶变换红外光谱仪，购自日本岛津公司。
１．２试验方法
１．２．１材料收集与处理虾壳与蟹壳剔除残留肉质和污物，先用自来水洗净晾干，再用超纯水清洗２～３次，晾干，置于干燥箱，６０ ℃烘至恒重，粉碎，过４０目筛，得到样品。
１．２．２虾蟹壳提取甲壳素工艺流程基本原理：虾壳、蟹壳中除了甲壳素，其余主要是碳酸钙和蛋白质［６］。制备甲壳素的基本原理是脱钙、脱蛋白和脱色［７］。
基本流程：虾壳、蟹壳→清洗干燥→粉碎→HCl溶液脱钙→洗涤至中性→NaOH溶液脱蛋白→脱色→洗涤干燥→甲壳素。
１．２．３脱钙试验设计每组分别称取５．００ ｇ的虾壳、蟹壳粉于２００ ｍＬ的烧杯中，加入HCl溶液，浸泡，适时过滤，并洗涤滤渣，将滤液与洗涤液定容后，用ＥＤＴＡ络合滴定Ｃａ，得出脱钙量，确定最佳投料比以及虾壳与蟹壳中的含钙量。
１．２．４脱钙正交试验根据时杰等［８］甲壳素工艺单因素试验结果，虾壳、蟹壳脱钙过程中的影响因素有HCl溶液浓度、酸浸时间。为了得到较科学的提取方法，试验设计选取HCl溶液用量、HCl溶液浓度、酸浸时间３个因素，设计三因素三水平的正交试验，以甲壳素的脱钙量作为评价指标。正交试验因素与水平见表１。
１．２．５脱蛋白、脱色工艺分别称取５．００ ｇ已经脱钙的虾壳粉、蟹壳粉于２００ ｍＬ烧杯中，加入１５０．００ ｍＬ ２．００％氢氧化钠溶液，在室温下浸泡２４ ｈ，过滤并洗涤滤渣，滤液与洗涤液用１．００ ｍｏｌ／Ｌ的HCl溶液滴定，得出脱蛋白过程中所需用碱量；同时滤液用凯氏定氮法测定其含氮量，确定虾壳与蟹壳中的蛋白质含量。每组试验３次重复，取平均值。
将酸碱浸处理后的虾壳、蟹壳水洗至中性，与１００ ｍＬ的１０％过氧化氢溶液混合，在室温下浸泡２ ｈ，洗净干燥得到白色固体产品即为甲壳素。
１．２．６红外光谱检测将甲壳素样品与市售食品级甲壳素在玛瑙研钵中研细后，分别与ＫＢｒ粉末混研，待样品与ＫＢｒ混合均匀，装入模具内放在油压机上加压，使之成为透明的晶片，测定其红外光谱。
２结果与分析
２．１脱钙正交试验结果
从表２中可知，影响虾壳脱钙因素的大小顺序为Ｂ、Ｃ、Ａ，最佳提取方法为Ａ２Ｂ３Ｃ１，即酸浸时间为６ ｈ，HCl溶液浓度为１．５０ ｍｏｌ／Ｌ，盐酸用量为５０．００ ｍＬ。Ａ２Ｂ３Ｃ１组合在正交试验组合中得到的虾壳脱钙量为０．４５２ ８ ｇ；影响蟹壳脱钙因素的大小顺序为Ｂ、Ｃ、Ａ，最佳提取方法为Ａ２Ｂ３Ｃ２，即酸浸时间为６ ｈ，HCl溶液浓度为１．５０ ｍｏｌ／Ｌ，HCl溶液用量为７５．００ ｍＬ。由于Ａ２Ｂ３Ｃ２组合不在正交试验组合中，因此进行验证性试验，得到蟹壳中脱钙量为０．６４１ ５ ｇ，高于试验中得到的最大值０．６０２ ４ ｇ，故试验结果可靠。
２．２脱蛋白、甲壳素含量
按照时杰等［８］的虾壳、蟹壳脱蛋白最佳工艺，氢氧化钠浓度为２．００％、碱浸时间为２４ ｈ探究虾壳与蟹壳蛋白质的含量以及脱蛋白的用碱量。结果表明，５．００ ｇ虾壳脱蛋白过程中平均用碱量为３６．３０ ｍＬ，平均含氮量为３．７１％，平均蛋白质含量为２３．１９％；５．００ ｇ蟹壳脱蛋白过程中平均用碱量为２５．０３ ｍＬ，平均含氮量为２．６８％，平均蛋白质含量为１６．７５％。
利用正交试验提取虾壳、蟹壳中甲壳素，在最佳脱钙工艺条件下，得到虾壳中甲壳素含量为２２．４０％，蟹壳中甲壳素含量为１９．８０％。
２．３红外光谱检测
由于物质的红外光谱与物质之间有着对应关系，光谱（带）的位置、强度和数目能反映出物质分子中原子质量、化学键的性质以及分子的构型［９］。因此，在高分子材料的剖析工作中，红外光谱法是鉴定各种聚合物最有效的方法［１０］。
图１、图２为虾蟹壳中甲壳素与市售食品级甲壳素的红外光谱。在虾蟹壳甲壳素红外光谱中，３ ３５４ ｃｍ－１处的峰为Ｏ－Ｈ伸缩振动，２ ８５０ ｃｍ－１处的一组峰为ＣＨ２不对称伸缩，１ ６6５ ｃｍ－１的峰为酰胺Ⅰ谱带，１ ３１２ ｃｍ－１处的为酰胺Ⅲ谱带，１ １５８ ｃｍ－１的峰为υ（Ｃ－Ｏ－Ｃ），１ ０７５ ｃｍ－１处的峰为Ｃ－Ｏ伸缩振动。图２与图１大致相同，其在１ ３１２ ｃｍ－１和１ ５５８ ｃｍ－１处出峰的差异说明２个样品的脱乙酰度不同。
３小结
在利用不同材料制取甲壳素的过程中，发现虾壳中的甲壳素含量为２２．４０％，蟹壳中甲壳素含量为１９．８０％；而在酸浸碱浸的废液中，发现虾壳钙含量为９．０６％，蛋白质含量为２３．１９％；蟹壳中钙含量为１２．８３％，蛋白质含量为１６．７５％。目前，我国在对甲壳素领域的研究中取得了一些成果，但是与发达国家相比还有一定的差距，因此有必要充分利用再生资源，加强对甲壳素的研究，为未来虾蟹壳变废为宝提供更好的应用前景。
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参考文献：
［１］ 蒋小姝，莫海涛，苏海佳，等．甲壳素及壳聚糖在农业领域方面的应用［Ｊ］．中国农学通报，２０１３，２９（６）：１７０－１７４．
［２］ 李区．甲壳素及其衍生物壳聚糖的应用研究进展［Ｊ］．广西水产科技，２００６（１）：３５－３８．
［３］ 李睿，刘斌．甲壳素的分离提取及其性质研究［Ｊ］．江苏教育学院学报，２０１０，２６（１２）：４５－４８．
［４］ 钱清华．海洋生物中牛磺酸、多糖、肽等活性物质的提取研究进展［Ｊ］．食品工业科技，２０１３，３４（１３）：３８３－３８７．
［５］ 吴清基，吴鸿昌．甲壳素——２１世纪的绿色材料［Ｊ］．东华大学学报，２００４，３０（１）：１３４－１３８．
［６］ 谢雅明．可溶性甲壳质的制造和用途［Ｊ］．化学世界，１９８３（４）：１１８．
［７］ 郭开宇，赵谋明．甲壳素／壳聚糖的研究进展及其在食品工业中的应用［Ｊ］．食品与发酵工业，１９９９，２６（１）：５９－６４．
［８］ 时杰，刘平怀，刘洋洋，等．海南产虾蟹壳制取甲壳素的工艺研究［Ｊ］．海南师范大学学报，２０１０，２３（３）：２９5－２９９．
［９］ 郑继忠，孙宾宾．红外光谱及其在甲壳素化学研究领域的应用［Ｊ］．广州化工，２０１４，４２（１）：２４－２５．
［１０］ 高炜斌．红外光谱法在高分子材料分析中的应用［Ｊ］．科技信息，２００８（２９）：２５２.