胡玉龙，李雪华，赵苹艺，丁楚楚，徐甜甜，孙存华
（江苏师范大学生命科学学院，江苏 徐州 ２２１１００）
摘要：采用水培法，以甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ Ｌａｍ．）宁紫薯一号为材料，研究重金属镉（Ｃｄ２＋）对其叶绿素含量、脂膜过氧化程度、活性氧含量以及抗氧化酶活性的影响。结果表明，镉胁迫下甘薯叶片总叶绿素含量减少；膜脂过氧化产物丙二醛含量升高；超氧阴离子产生速率增加，过氧化氢含量升高；ＳＯＤ、ＣＡＴ活性先上升后下降，ＰＯＤ活性在处理期间一直处于上升趋势。镉胁迫导致甘薯叶片光合作用减弱，衰老加速。同时甘薯植株也会对镉胁迫作出相应反应，保护酶活性上升降低了镉引起的细胞氧化损坏，维护了细胞的正常新陈代谢。
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关键词 ：镉胁迫；甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ Ｌａｍ．）；脂膜过氧化；抗氧化酶
中图分类号： Ｓ５３１；Ｑ９４５．７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０４－０８５８－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０４．０２１
收稿日期：２０１４－０６－３０
作者简介：胡玉龙（１９８８－），女，湖北荆州人，在读硕士研究生，研究方向为生物遗传与环境，（电话）１５１９０６６８５２５（电子信箱）８４６２１０５３８＠ｑｑ．ｃｏｍ。
由于自然因素和人类活动的影响，以及酸雨作用使得土壤中Ｃｄ２＋的可溶性增加，导致土壤毒性增强，区域性土壤Ｃｄ２＋污染严重，如农田与森林生态系统。农田Ｃｄ２＋污染直接导致农作物减产和高Ｃｄ２＋的积累［１］。Ｃｄ２＋通过根的吸收进入植物体，并在植物体内转移储存。Ｃｄ２＋通过与酶的活性中心结合以及干扰植物体内的元素平衡等方式影响植物体的正常生理活动。镉元素对人体而言是一种有毒的重金属元素，可通过食物链进入人体，长期食用含镉的食物容易造成镉在人体肾脏、肝、骨质等组织内的积累，损坏人体相关组织功能，危害身体健康。镉元素在人体内的积累可引发水蛋白症、肾结石等一系列的肾损伤临床表现。早期研究表明，镉元素具有致癌作用。镉对蛋白质的毒性作用，包含对抗氧化酶的破坏，影响了机体对自由基的清除，从而导致细胞膜以及与癌变过程有关的ＤＮＡ的损伤［２］。
甘薯（Ipomoea batatas Lam.）又称地瓜、白薯、红薯、番薯等，为旋花科一年生植物，属世界性块根粮食。中国是世界上最大的甘薯生产国，甘薯种植面积和总产量约为世界总种植面积和总产量的７０％～８５％，且甘薯品种资源丰富，中国保存的甘薯种质资源约有２ ０００份［３］。甘薯适应能力强，生物产量和经济产量高，既可以作为粮食作物和饲料作物，也可以作为能源作物，通过加工形成乙醇。甘薯不仅营养价值丰富，而且具有抗癌、食疗以及工业价值。甘薯对土壤中的镉有一定的吸收积累能力，在轻度镉污染（０．５７ ｍｇ／ｋｇ）条件下，湘薯１５、泉薯９号等甘薯茎叶镉含量超过了无公害质量标准［４］，绵粉１号与绵薯８号、绵薯４号薯块存在镉超标，特别是绵薯５号镉含量为１１０ μｇ／ｋｇ，为土壤含镉量的１７．９％［５］，说明轻度镉污染土壤种植的甘薯存在一定的摄食健康风险，同时也给甘薯生长发育带来胁迫伤害。本研究探讨甘薯对镉胁迫的生理和分子响应机制以及如何提高甘薯对镉胁迫的耐受性，旨在揭示重金属镉对甘薯叶片生理生化方面的影响，以及甘薯在镉胁迫下自我调节保护的机制。
１ 材料与方法
１．１ 供试材料
以甘薯宁紫薯１号为供试材料。２０１３年４月将薯块种入苗床，约2周后，苗床上长出甘薯幼苗。在苗床上培养幼苗１周后，将幼苗移栽于盆中培养。待幼苗枝叶旺盛，采其茎（含叶片）作为试验材料。
１．２ 方法
将长势相似的幼苗用去离子水洗净后用霍格兰营养液培养。１周后，茎生根，分两组分别用标准霍格兰营养液和含１００ μｍｏｌ／Ｌ的ＣｄＣｌ２的霍格兰营养液处理幼苗（每隔２ ｄ换一次营养液），置于２５ ℃／２０ ℃（白天／夜晚）培养箱中、每天１２ ｈ光照条件下培养，记录８ ｄ内不同处理幼苗的生长情况。每隔１ ｄ上午９：００定时采样，选取植株倒数第３片至第１０片叶进行生理指标的测定，每个指标重复测定３次。
采用紫外吸收法测定叶绿素含量［６］；采用硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛（ＭＤＡ）含量［７］；采用ＴｉＣｌ２显色法测定过氧化氢含量［７］；采用羟胺反应法测定超氧阴离子含量［８］；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶活性［８］；采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶活性［８］；采用愈创木酚法测定过氧化物酶活性［８］。以上试验均重复取材测定３次，取平均值。
１．２ 数据统计分析
采用Ｅｘｃｅｌ ２０１３软件进行数据计算，Oｒｉｇｉｎ７．５软件进行绘图分析，ＳＰＳＳ１６．０软件进行方差分析。
２ 结果与分析
２．１ 镉离子对甘薯叶片叶绿素含量的影响
由图１可知，对照组甘薯叶片在８ ｄ内叶绿素含量平缓上升，而镉胁迫下，甘薯总叶绿素含量逐渐下降，处理第２天至第４天下降幅度达到整个处理阶段的最大程度。处理第２天，甘薯叶片叶绿素含量略小于对照组，但不显著；在第４天处理组叶绿素含量显著（Ｐ＜０．０５）低于对照，对照叶片叶绿素平均含量为２．３６０ ｍｇ／（ｇ·ＦＷ），镉处理组叶绿素含量为１．７２８ ｍｇ／（ｇ·ＦＷ）。第６天对照组叶片叶绿素含量达到镉处理组的１．６倍，第８天达到镉处理组近２倍，且差异达到显著水平（Ｐ＜０．０５）。
２．２ 镉离子对甘薯叶片ＭＤＡ含量的影响
植物细胞膜在逆境条件下，会发生脂膜过氧化，ＭＤＡ是脂膜降解的最主要产物之一。通常将其作为脂膜过氧化程度的一个指标，用于表示细胞膜受损害的程度和植物对逆境抵抗力的强弱。由图２可知，在８ ｄ内对照叶片ＭＤＡ的含量保持稳定状态，而镉处理甘薯叶片脂膜氧化程度急剧加大。在处理第２天达到显著水平（Ｐ＜０．０５），是对照ＭＤＡ含量的１．３倍；在镉离子胁迫第８天，丙二醛含量与对照相比，达到极显著水平（Ｐ＜０．０１）。
２．３ 镉离子对甘薯叶片活性氧含量的影响
活性氧类（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）是生物有氧代谢过程中的副产物，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢和羟基自由基等。活性氧由于存在未配对自由电子，化学性质十分活跃。过高的活性氧水平引起细胞和基因结构的损坏。活性氧的爆发是植物衰老的特征之一。植物在逆境中，活性氧将逐渐积累，破坏植物器官，加速植物的衰老。
２．３．１ 镉胁迫下过氧化氢含量的变化 过氧化氢是氧代谢反应中间产物之一。由图３可见，镉离子胁迫下，甘薯叶片过氧化氢逐渐累积，与正常培养条件下的甘薯叶片相比，第4天累积量是对照组含量的１．７倍，差异达到显著水平（Ｐ＜０．０５），第８天处理组含量达到１２５．６３ nｍｏｌ／（ｇ·ＦＷ），是对照组的３．２倍，差异达到极显著水平（Ｐ＜０．０１）。随着胁迫天数的增加，过氧化氢产生的速率不断增加，叶片衰老程度也随之加深。
２．３．２ 镉胁迫下超氧阴离子自由基含量的变化 超氧阴离子自由基是生物体内的活性氧之一，超氧阴离子自由基可以转化成攻击性更强的羟基自由基，进而引发脂膜的氧化和脱脂化，直接攻击核酸、蛋白质等，从而导致核酸结构的损坏、蛋白质聚合、多肽链断裂、酶蛋白失活等。如图４所示，在镉离子胁迫下，超氧阴离子自由基产生速率逐渐升高，在第６天超氧阴离子自由基产生速率为对照组的１．６倍，差异达到显著水平（Ｐ＜０．０５）；胁迫第８天其产生速率约为对照的１．７倍，差异达到极显著水平（Ｐ＜０．０１）。
２．４ 镉离子对甘薯叶片保护酶活性的影响
２．４．１ 镉胁迫下ＣＡＴ活性的变化 镉离子处理甘薯叶片后，其ＣＡＴ活性呈现先上升后下降的趋势。在第４天过氧化氢酶活性极速上升，对照组叶片过氧化氢酶活性为３７０．９ Ｕ／（ｇ·ＦＷ），镉胁迫叶片过氧化氢酶活达到６７４．５ Ｕ／（ｇ·ＦＷ） ，是对照组的１．８倍；第６天达到最大值，第８天处理组ＣＡＴ 酶活急剧下降为５８７．１ Ｕ／（ｇ·ＦＷ）。
２．４．２ 镉胁迫下ＳＯＤ活性的变化 超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是脂膜过氧化防御系统的主要保护酶，其催化活性氧发生歧化反应产生过氧化氢和单线态氧，从而避免植物遭受严重损害。较高的超氧化物歧化酶活性是植物抵抗逆境胁迫的生理基础。在镉离子胁迫下，甘薯叶片ＳＯＤ活性表现为先上升后下降的趋势。在镉胁迫前６天，ＳＯＤ活性逐渐上升，第４天其含量为对照的１．４倍，差异达到显著水平（Ｐ＜０．０５）；在第６天ＳＯＤ活性达到最大值，为对照组的２．６倍，差异达到极显著水平（Ｐ＜０．０１）；而后镉胁迫下甘薯叶片ＳＯＤ活性呈现下降趋势。
２．４．３ 镉胁迫下ＰＯＤ活性的变化 正常处理的甘薯叶片在８ ｄ内其ＰＯＤ活性维持在一个相对稳定的区间，镉离子胁迫下的甘薯叶片ＰＯＤ活性呈现上升趋势；在０～４ ｄ内平缓上升，第６天上升幅度达到最大，ＰＯＤ活性是正常处理的２．３倍，差异达极显著水平（Ｐ＜０．０１），胁迫第８天达最大值。
４ 小结与讨论
通过本试验可知，镉胁迫造成甘薯叶片叶绿素含量下降，活性氧含量逐渐上升，直接或间接导致细胞膜脂过氧化，在短时间内保护酶活性增加。在长期的进化过程中，甘薯形成了一套自我保护机制，保护酶如ＳＯＤ、ＣＡＴ等活性的提升在一定程度上缓解了植物细胞氧化程度，减轻了细胞受到的伤害，增强了植物对镉的耐受性。同时，本研究结果表明，镉胁迫条件下过氧化物酶对甘薯有着更长久的保护作用，且镉胁迫对甘薯幼苗的伤害和活性氧爆发的程度与胁迫时间呈正相关性。
叶绿素是光合作用的物质基础，其含量高低直接影响光合作用的强弱及物质合成速率。植物对镉元素的积累将影响植物体内叶绿素的含量，降低光合作用速率。本研究中，镉胁迫条件下甘薯宁紫一号叶片于第２天有变黄迹象，至第４天，叶片明显变黄、萎蔫，总叶绿素含量呈现逐渐下降的趋势，而对照中叶绿素含量呈上升趋势。这与以往研究结果类似，如镉胁迫条件下绿豆芽的叶片随胁迫时间的延长叶片明显变黄［９］；菹草葵在镉胁迫４ ｄ后，叶片也出现明显枯黄现象，并且植株生长出现明显病态症状［１０］。这种现象出现的原因可能是镉离子影响了叶绿素合成所需要的酶的结构。重金属镉对植物光合系统的毒害是对光合作用过程及植物体内相关生理活动的整体伤害［１１］，包括对叶绿素结构的破坏，光能的吸收、转变过程的破坏及构成光合系统所需物质的合成过程的破坏等。
镉胁迫条件下，植株体内将产生大量的活性氧，这些活性氧将与脂膜的不饱和脂肪酸发生脂膜过氧化反应，产生大量的ＭＤＡ。本研究中，镉胁迫条件下甘薯叶片ＭＤＡ逐渐累积，超氧阴离子自由基产生速率不断升高，过氧化氢含量上升。以往研究中，镉处理玉米植株也有类似现象，玉米叶片超氧阴离子自由基产生速率迅速升高，Ｈ２Ｏ２随镉浓度和处理时间的增加而大量积累［１２］。活性氧的爆发在某种程度上表明了环境对植物带来的伤害程度，镉对甘薯幼苗的损害程度随着胁迫时间的延长愈发严重，最终导致细胞膜系统结构的稳定性和功能的完整性被破坏。
植物自身拥有相应的防御抵抗系统应对重金属镉胁迫。其中重金属的区隔化和保护酶体系是较为重要的防御体系。在细胞壁的沉淀以及细胞内的区隔化分布（如液泡作为规避镉的场所可限制金属在植物体内的移动），降低镉对植物的毒性［１３，１４］ 。植物保护酶体系将对镉迁移给植物带来的伤害进行防御抵抗，本试验主要探讨保护酶对甘薯的保护机制。镉胁迫导致甘薯叶片抗氧化酶（ＰＯＤ、ＳＯＤ和ＣＡＴ）活性增加，而抗氧化酶活性的增加与植物对逆境胁迫的耐性有着直接的关系［１５］。有研究表明轻度镉胁迫有利于提高水稻的ＳＯＤ活性，而高浓度镉胁迫对水稻的ＳＯＤ活性有抑制作用［１６］。本试验中，镉胁迫条件下甘薯叶片ＰＯＤ与ＳＯＤ、ＣＡＴ相比维持较高的酶活状态最长，而POD在８ ｄ内酶活一直处于上升阶段，说明在镉胁迫后期，ＰＯＤ发挥着对植物更好的保护作用。这与干旱胁迫下大豆的保护酶特征类似［１7］，而3者中ＣＡＴ对镉胁迫的敏感度更高。
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