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柑橘不同部位中柠檬苦素的分布及含量分析

  • 投稿南瓜
  • 更新时间2015-09-22
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吴今人1a,耿 平1a,胡田叶1a,霍晨曦1a,江 海1a,1b,郭念文2,刘惠钧3

(1. 陕西理工学院,a.生物科学与工程学院;b.陕西省资源生物重点实验室 陕西 汉中 723001;2.陕西泛亚绿色食品有限公司,陕西 城固 723200;3. 陕西省城固酒业有限公司,陕西 城固 723200)

摘要:利用UPLC-MS/MS检测柑橘不同部位中的柠檬苦素含量,以了解柑橘中苦味物质的分布规律,从而为柑橘产品深加工提供依据。试验采用色谱柱Waters ACQUITY BEH C18(50 mm ×2.5 mm,1.9 μm);流动相:A为乙腈,B为纯水,梯度洗脱,乙腈梯度为10%(0 min)-50%(3 min)-10%(4 min)-10%(5 min);流速0.3 mL/min、柱温40 ℃、进样量5 μL、检测时间5 min;正离子模式(ESI+)质谱检测器:柠檬苦素母离子m/z=471.1;定性离子m/z=425.3,定量离子m/z=161.1;等等。结果表明,柑橘不同部位中柠檬苦素的含量差异显著,橘茎、橘叶、橘花、橘皮、橘络、橘肉、橘子的柠檬苦素含量分别为980.5±15.8、880.0±10.2、2 500.0±30.5、768.4±9.6、1 780.0±20.5、220.2±8.1、3 200.0±35.1 mg/kg。说明柑橘中柠檬苦素主要分布于橘花、橘络、橘子中,可以通过橘花、橘子提取;所以在柑橘加工过程里,为避免苦味的产生,应尽量剔除橘络和橘子。

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关键词 :柑橘;柠檬苦素;分布;含量

中图分类号:S666;O629.6+1;Q946-33 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2015)04-0882-04

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.04.028

收稿日期:2014-04-14

基金项目:陕西省教育厅科研项目(2011GJ21;2011JS033);陕西理工学院大学生创新创业训练计划项目(UIRP13040)

作者简介:吴今人(1993- ),男,陕西汉中人,2011级本科生,研究方向为食品质量安全控制,(电话)13909162895;通信作者,江 海(1977-),男,四川西昌人,高级实验师,硕士,主要从事食品质量与安全控制技术研究,(电子信箱)jianghai0318@163.com。

柑橘属(Citrus L.)是芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideae)植物,以柠檬[C. limon(L.)Burm.F]、柚[C.maxima(Burm.)Merr.]、葡萄柚(C. paradisi Macf)、甜橙[C. sinensis(L.)Osbeck]、宽皮橘(Citrus reticulata Blanco)为主要栽培种类[l-4],在世界上分布于南纬、北纬40°的热带、亚热带的135个国家和地区,是世界上种植面积最大、产量最多的商品水果之一[5-7]。柑橘是一种古老的果树,在中国有四千多年的栽培历史。柑橘中富含糖、维生素、纤维素、胡萝卜素、橙皮苷、柚皮苷、柠檬苦素等物质,其中橙皮苷、柚皮苷、柠檬苦素既是柑橘的风味物质,同时也是柑橘及其加工产品苦味的主要来源。柠檬苦素是一种三萜类的植物次生代谢产物,广泛存在于柑橘属植物中,至今已从柑橘属植物中分离出了36种柠檬苦素类似物及17种柠檬苦素类似物配糖体[8,9]。据报道,柠檬苦素在水溶液中的苦味阈值约为1×10-6 mol/L。有强烈苦味的柠檬苦素如果在柑橘果汁中的含量超过6 mg/L,那么这种柑橘就不适合用于果汁加工[10]。

柠檬苦素对柑橘的加工有一定的负面影响,但柠檬苦素类化合物在抗癌、镇痛、调节体内胆固醇水平、防止动脉粥样硬化和除虫等方面具有明显效应[11],柠檬苦素类似物除以上的生物学功效之外,还具有抗氧化、抗菌、抑制HIV、利尿、改善心脑血管循环及睡眠、抗病毒、调节细胞色素等作用,具有很好的保健功能[12,13]。柑橘中的柠檬苦素类物质是柑橘产品开发利用过程中重要的苦味来源,是影响柑橘产品品质的主要因素;同时,因为柑橘中的这些苦味物质在医药、临床治疗以及食品生产中具有一定的功效,所以摸清柑橘中柠檬苦素类物质的分布规律就具有重要意义。

目前分析柠檬苦素的主要方法有光谱分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、色谱-质谱联用法、微波法,萃取法[14-16]。试验在借鉴前人研究的基础上,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析了柑橘不同部位中柠檬苦素的含量,旨在摸清柑橘植株中柠檬苦素的分布规律,为柑橘的加工去苦和柠檬苦素的提取提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 柑橘的茎、花、叶、果皮、果肉、橘络、橘子等均采于陕西泛亚绿色食品有限公司城固县郭家山柑橘种植基地,样品都于烘箱内60 ℃烘干、粉碎后过60目分样筛,备用。

1.1.2 试剂 主要有柠檬苦素(纯度为99.8%,天津一方科技有限公司)、甲醇(分析纯,天津市登峰化学试剂厂)、乙腈(色谱纯,Burdick and Jackson 公司)、纯水(杭州娃哈哈矿泉水)。其他为实验室常用的试剂如石油醚、丙酮等。

1.1.3 仪器 主要有Waters ACQUITY-UPLC-TQD(美国Waters公司)、Shimadzu AUW220D电子天平(日本岛津公司,感量1/100 000)、KQ100-DA超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)、101-3A型电热恒温鼓风干燥箱(上海沪南电炉烘箱厂)、ZN-02中草药粉碎机(北京兴时利和科技发展有限公司);其他为实验室常规仪器。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 称取干燥、粉碎后的柑橘茎、花、叶、果实、果皮、橘络、橘子样品各0.200 g于250 mL的圆底烧瓶中,量取50 mL石油醚(30~60 ℃)于40 ℃超声脱脂30 min,抽滤,弃去滤液;向滤渣中加入50.0 mL丙酮,40 ℃超声提取30 min,过滤;滤液挥干,用50%乙腈水溶液定容于50 mL容量瓶。过0.22 μm有机微孔滤膜后,在设定的液相-质谱条件下检测。

1.2.2 标准品制备 精密称取柠檬苦素标准品1.50 mg,用10 mL乙腈溶解后,超纯水定容至25.0 mL。制得柠檬苦素60.0 mg/L浓度的标准对照母液。分别取柠檬苦素标准母液0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 mL,用50%的乙腈水溶液定容于10.0 mL容量瓶中,得到柠檬苦素0.30、0.60、3.00、6.00、12.00 mg/L的标准工作溶液。

1.2.3 色谱条件 ACQUITY-UPLC BEH C18色谱柱(2.5 mm×50 mm,1.9 μm),柱温40 ℃,流速0.3 mL/min,进样5 μL。流动相为水与乙腈梯度洗脱,乙腈梯度为10%(0 min)-50%(3 min)-10%(4 min)-10 %(5 min)。

1.2.4 质谱条件 毛细管电压3.2 kV,锥孔电压40 kV,离子源温度110 ℃,脱溶剂气温400 ℃,锥孔气流量50 L/h,脱溶剂气流量800 L/h。离子化模式为大气压电喷雾离子源正离子模式(ESI+),碰撞池电压(collision V)30 V,碰撞氩气流速0.14 mL/min。采用多反应监测(MRM)方式。

1.2.5 标准曲线制备 在仪器设定的色谱-质谱条件下,进标准梯度溶液各5.0 μL,MRM检测柠檬苦素母离子m/z=471.1,定性离子m/z=425.3,定量离子m/z=161.1。以定量离子m/z=161.1峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制标准工作曲线。

1.3 试验方法学评价

1.3.1 精密度试验 取柑橘同一部位材料样品,按1.2.1方法制备样品,在色谱-质谱条件下平行测定5次,每次进样5 μL,测定柠檬苦素的峰面积,计算相对标准偏差(RSD),考察方法的精密度。

1.3.2 重复性试验 取柑橘同一部位材料样品,按1.2.1方法平行制备5个样品,在色谱-质谱条件下测定,每个样进样5 μL,测定柠檬苦素的峰面积,计算相对标准偏差(RSD),考察方法的重复性。

1.3.3 稳定性试验 取柑橘同一部位材料样品,按1.2.1方法平行制备5个样品,在色谱-质谱条件下测定,分别于0.5、1、6、12、24 h进样5 μL,检测柠檬苦素的峰面积,计算相对标准偏差(RSD),以考察方法的稳定性。

1.3.4 回收率试验 精密量取已测定柠檬苦素为2 500 mg/kg的柑橘各部位样品0.2 g,加入60.0 mg/L的标准对照母液3.0 mL(180 μg),按1.2.1方法制备样品,在色谱-质谱条件下平行进样3次,每次进样5 μL,以标准曲线计算其含量,通过加标回收率公式计算各样品的回收率。

1.3.5 定量限试验 将含柠檬苦素0.12 mg/L的标准溶液逐级稀释,在液相质谱分析条件下进样分析,以RS/N=10 确定柠檬苦素的定量限。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的确定

试验标样的色谱-质谱图见图1,以标准溶液浓度为横坐标,定量离子m/z=161.1峰面积为纵坐标,拟合标准工作曲线,得到柠檬苦素线性回归方程:y=620.78x+80.24,其相关系数r=0.998 7。该检测条件下,柠檬苦素在0.30~12.00 mg/L之间线性关系良好。

2.2 方法学评价

2.2.1 精密度试验 在色谱-质谱条件下,按精密度试验方法测得柑橘茎样品(柠檬苦素含量3.92 mg/L)的柠檬苦素峰面积分别为2 568.12、2 513.45、2 456.23、2 598.64、2 410.55,计算得到其相对标准偏差(RSD)为3.09%。同理测得柑橘其他部位样品的相对标准偏差(RSD)分别为:柑橘叶2.84%、花2.31%、皮3.36%、果肉4.08%、橘络2.17%、橘子1.95%,不难看出,在所有精密度试验中,相对标准偏差(RSD)都小于5%,表明在该条件下采用的方法精密度良好。

2.2.2 重复性试验 在色谱-质谱条件下按重复性试验的方法测得平行处理的5个柑橘茎样品中柠檬苦素的峰面积分别为2 612.23、2 548.87、2 579.69、2 458.63、2 411.76,计算得其相对标准偏差(RSD)为3.33%。同理测得柑橘其他部位样品的相对标准偏差(RSD)分别为柑橘叶2.77%、花2.41%、皮3.13%、果肉4.58%、橘络2.37%、橘子2.25%。所有部位的相对标准偏差(RSD)都小于5%,表明在该条件下采用的方法重复性良好。

2.2.3 稳定性试验 在色谱-质谱条件下按稳定性试验方法,测得柑橘茎样品柠檬苦素的峰面积分别为2 625.11、2 593.21、2 413.16、2 511.84、2 535.53,计算得其相对标准偏差(RSD)为3.23%。同理测得柑橘其他部位样品的相对标准偏差(RSD)分别为柑橘叶3.17%、花2.64%、皮3.35%、果肉4.32%、橘络2.67%、橘子2.19%。所有部位的相对标准偏差(RSD)都小于5%,表明在该条件下采用的方法使样品稳定性良好。

2.2.4 回收率试验 精密量取已测定柠檬苦素为2 500 mg/kg的柑橘花样品0.2 g,加入180 μg柠檬苦素标准物质,按样品制备方法平行制备样品3份,在色谱-质谱条件下测定添加标准品后的柠檬苦素含量,计算柠檬苦素的回收率,结果见表1。从表1可见,该分析方法的平均回收率为103.6%,表明该方法的准确性良好;回收率的RSD为3.80%,小于5 %,表明该回收率试验的稳定性,重复性良好,检测方法结果可信。用同样的方法测得橘叶的柠檬苦素平均回收率为99.1%,RSD为4.15%;橘茎的柠檬苦素平均回收率为99.3%,RSD为4.03%;橘皮的柠檬苦素平均回收率为99.1%,RSD为4.23%;橘络的柠檬苦素平均回收率为102.3%,RSD为3.78%;橘子的柠檬苦素平均回收率为103.8%,RSD为3.15%;橘果肉的柠檬苦素平均回收率为98.1%,RSD为4.87%。所有部位的相对标准偏差(RSD)都小于5%,表明在试验条件下采用的方法使样品测定结果可信。

2.2.5 定量限试验 定量限试验结果显示,在液相-质谱分析条件下进样分析,得到RS/N=10,计算得到柠檬苦素的定量检测限为2.8 ng/mL。

2.3 样品中柠檬苦素分析结果

依样品制备方法和测定条件,对柑橘样品中的柠檬苦素质量分数实施测定,得到橘花的结果见图2、所有部位的结果见表2。从图2、表2可见,柑橘中的苦味物质柠檬苦素主要分布在柑橘子(3 200 mg/kg)、柑橘花(2 500 mg/kg)、橘络(1 780 mg/kg)中;柑橘皮、茎、叶中的柠檬苦素含量较低,并且三者含量大体相当;以柑橘果肉的柠檬苦素含量(220 mg/kg)最低。

3 讨论

现在关于柑橘中苦味物质的研究越来越多,主要集中在柑橘加工业中产品脱苦和柑橘苦味物质的药用价值两个方面[17-19]。前人研究证明,柑橘中苦味物质有各种各样的生理活性和药理功效,如抗癌、消炎等,开发利用柑橘中的柠檬苦素将有效提高柑橘的综合利用价值,延长柑橘的产业链。

试验结果显示,柑橘的苦味物质主要存在于柑橘的子、花和橘络中,因此在柑橘加工前的整理过程中为避免苦味,应尽量剔除橘络和橘子,并且橘皮也要剔除,这将有效降低加工过程的苦味物质脱除成本。而对于提取柑橘中的柠檬苦素而言,最好的原料是橘子和橘花,材料来源最丰富的是橘皮、橘叶、橘茎。

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(责任编辑 王珞)