代现平，班翠红
（滨州医学院药学院，山东 烟台 ２６４００３）
摘要：以提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数为考察因素，以单叶蔓荆（Ｖｉｔｅｘ ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ Ｌ．）总黄酮得率为考核指标，应用正交试验对其提取工艺进行优化。结果表明，单叶蔓荆中总黄酮的最佳提取工艺为提取温度７０ ℃、时间１ ｈ、固液比１∶１２（ｍ∶Ｖ）、乙醇体积分数７０％。该提取工艺简单、高效，适用于单叶蔓荆的总黄酮提取。
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关键词 ：单叶蔓荆（Ｖｉｔｅｘ ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ Ｌ．）；总黄酮；正交试验；提取工艺
中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1163-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.034
收稿日期：２０１４－０７－２９
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７０３２０）
作者简介：代现平（１９７０－），男，河南鹤壁人，副教授，博士，主要从事天然活性成分研究，（电话）１３６２５３５７８３６（电子信箱）ｘｉａｎｐｉｎｇｄ＠１６３．ｃｏｍ。
牡荆属（Ｖｉｔｅｘ Ｌ．）植物为马鞭草科灌木或乔木，主要分布在热带及温带地区。在我国有１４种，主要分布在长江以南地区，在东北、华北、西北等地也有少量分布［１］。单叶蔓荆（Ｖｉｔｅｘ ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ Ｌ．）为牡荆属马鞭草科，辛苦微寒，具清利头目、疏散风热等功效，民间常用于头痛、眼痛、感冒等病症的治疗［２－７］。研究表明，单叶蔓荆的化学成分主要包括黄酮类、倍半萜、二萜类、三萜类、苯丙素类、甾类等物质［３－７］，其中黄酮类化合物为其主要活性成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、镇痛等多种药理作用［５－１１］。因此，研究单叶蔓荆中总黄酮的提取工艺具有重要意义。
本试验采用正交试验对单叶蔓荆提取工艺进行优化，对影响提取的各种因素及条件进行了探讨，旨在为单叶蔓荆的综合开发利用提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
单叶蔓荆由烟台益生堂药业有限公司提供，经滨州医学院药学院天然药物实验室鉴定为单叶蔓荆。
１．２ 仪器
Ｕ－１９０型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ＪＡ５００３Ｂ型电子天平、ＤＨＧ－９０５３型真空干燥箱（上海精密仪器仪表有限公司）；ＴＨＨ－６型恒温水浴锅（上海乔跃电子有限公司）；ＳＨＺ－Ⅲ型循环水式多用真空泵、ＲＥ－３０１型旋转蒸发仪（巩义市瑞德仪器设备有限公司）。
１．３ 试剂
芦丁对照品（中国药品生物制品检定所），其他试剂均为分析纯。
１．４ 方法
１．４．１ 单叶蔓荆中总黄酮含量的测定
１）供试样品溶液的制备。准确称取单叶蔓荆粗粉３０ ｇ，于１ ０００ ｍＬ烧瓶中，按要求加入不同体积分数乙醇溶液，加热回流提取一定时间，过滤，减压回收溶剂，干燥，称重，得到单叶蔓荆干膏。精确称取在不同提取条件下得到的单叶蔓荆干膏１０ ｍｇ，于１０ ｍＬ容量瓶中，用６０％乙醇溶解，定容后备用。
２）标准溶液的制备。精确称取于１２０ ℃干燥至恒重的芦丁对照品１０ ｍｇ，于１００ ｍＬ容量瓶中，加６０％乙醇３０ ｍＬ，水浴微热使其完全溶解，放冷，６０％乙醇定容至１００ ｍＬ，制成０．１００ ｍｇ／ｍＬ芦丁对照品溶液。
３）标准曲线的绘制。分别精确吸取芦丁对照溶液０、１．００、２．００、３．００、４．００、５．００ ｍＬ，分别加入２５ ｍＬ容量瓶中，各加０．７５ ｍＬ亚硝酸钠溶液（５０ ｍｇ／ｍＬ），摇匀，静置１０ ｍｉｎ；再加入０．７５ ｍＬ硝酸铝溶液（１００ ｍｇ／ｍＬ），摇匀，静置１０ ｍｉｎ；再加１０ ｍＬ氢氧化钠溶液（４０ ｍｇ／ｍＬ），６０％乙醇定容，摇匀，静置１０ ｍｉｎ。于５１０ ｎｍ波长处测吸光度，以吸光度Ａ为纵坐标，芦丁浓度Ｃ为横坐标，绘制标准曲线。
４）精密度试验。精确吸取２．０ ｍＬ芦丁对照溶液于２５ ｍＬ容量瓶中，按标准曲线绘制方法，平行操作５次，测定该方法的精密度。
５）稳定性试验。取适量供试溶液，按标准曲线绘制方法，于０、２、４、６、８ ｈ分别测定其吸光度，测定该方法的稳定性。
６）重复性试验。取同一批药材，按照以上方法制备供试样品溶液，并按标准曲线绘制所述方法测定吸光度，平行操作５次，测定该方法的重复性。
７）回收率试验。精确吸取６份已知含量供试样品溶液各０．５ ｍＬ，加入芦丁标准品溶液，按标准曲线绘制方法测定其吸光度，计算单叶蔓荆总黄酮的含量。
供试样品总黄酮含量测定：精确吸取５ ｍＬ供试样品溶液于２５ ｍＬ容量瓶中，按标准曲线绘制项方法测定其吸光度，并代入回归方程，计算单叶蔓荆总黄酮的含量。
１．４．２ 正交试验 为寻找最佳的提取条件组合，在单因素试验结果［单因素最佳条件为提取次数３次、提取温度６０ ℃、提取时间２ ｈ、固液比１∶１０（ｍ∶Ｖ，下同）和乙醇体积分数７０％］的基础上，应用正交试验设计，选择了主要影响提取效果的提取温度（Ａ）、提取时间（Ｂ）、固液比（Ｃ）和乙醇体积分数（Ｄ）作为考察因素，每个因素选择３个水平，以总黄酮含量作为考核指标，按照Ｌ９（３４）正交设计方案进行试验，正交试验因素及水平见表１。
１．４．３ 验证试验 采用筛选后得到的最佳工艺，进行验证试验，３次重复，按标准曲线绘制方法测定其吸光度，计算单叶蔓荆总黄酮含量。
２ 结果与分析
２．１ 标准曲线绘制
以吸光度Ａ为纵坐标，芦丁浓度Ｃ为横坐标绘制标准曲线，并进行线性回归分析，得到的回归方程为Ａ＝０．０５７ ０Ｃ－０．００８ ３（ｒ＝０．９９９ ８）。结果表明，芦丁在０．００４～０．０４５ ｍｇ／ｍＬ浓度范围与其吸光度呈良好的线性关系。
精密度试验结果表明，该测定方法ＲＳＤ＝０．２８％，表明其精密度良好。稳定性试验结果表明，该测定方法ＲＳＤ＝１．２７％，表明在８ ｈ内测定供试样品，其总黄酮含量基本稳定。重复性试验结果表明，该测定方法ＲＳＤ＝１．５２％，表明该方法具有良好的重复性。回收率试验结果表明，单叶蔓荆总黄酮平均回收率为９９．２９％，ＲＳＤ＝１．３５％，表明该方法可行。
２．２ 单叶蔓荆总黄酮提取工艺优化
２．２．１ 正交试验结果 正交试验试验结果见表２，方差分析结果见表３。结果表明，影响单叶蔓荆总黄酮提取的主次因素依次为Ａ、Ｄ、Ｃ、Ｂ，即提取温度、乙醇体积分数、固液比、提取时间。方差分析结果表明，因素Ａ和Ｄ对试验结果有极显著影响，因素Ｃ对试验结果有显著影响。按照方差分析结果，只对有显著影响因素选择最佳水平，而试验结果影响不大的因素则按照实际需要选择合适的水平。因此，单叶蔓荆总黄酮提取最佳工艺确定为提取温度７０ ℃、提取时间１ ｈ、固液比１∶１２、乙醇体积分数７０％，即Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２。
２．２．２ 验证试验 验证试验结果表明，单叶蔓荆总黄酮的含量分别为２．５０、２．４９、２．５２ ｍｇ／ｇ，平均含量为２．５０ ｍｇ／ｇ，ＲＳＤ＝０．６３％（ｎ＝３），表明该工艺条件稳定、可靠。
３ 小结与讨论
在前期单因素试验中，对单叶蔓荆总黄酮提取过程中粒度、提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数单因素进行筛选，结果单叶蔓荆粒度对提取效率的影响很小，因此选择对提取效率有较大影响的提取温度、提取时间、固液比和乙醇体积分数为考察因素，进行正交试验，优选其最佳提取条件。经正交试验结果分析，发现影响单叶蔓荆总黄酮提取主次因素依次为提取温度、乙醇体积分数、固液比、提取时间。经综合分析各种因素，选定Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２为单叶蔓荆总黄酮最佳的提取工艺，即提取温度７０ ℃、提取时间１ ｈ、固液比１∶１２、乙醇体积分数７０％，按此条件提取，总黄酮含量达到２．５０ ｍｇ／ｇ，并通过验证试验表明该提取工艺稳定、可靠。
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参考文献：
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