袁 俊，阮 鸣，周益倩，陈 静
（南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，南京 ２１１１７１）
摘要：采用正交设计对水浸提法、水浸提＋微波辅助法、乙醇浸提法、乙醇浸提＋微波辅助法进行比较，以咖啡提取物中绿原酸的含量为评判指标，考察时间、温度、乙醇体积分数、微波功率等对提取物有效成分绿原酸含量的影响。采用高效液相色谱法测定该成分的含量。结果表明，绿原酸最佳提取工艺为乙醇浸提＋微波辅助法，最佳提取条件为微波时间5 min，功率３００ Ｗ，乙醇体积分数６０％，此条件下提取绿原酸的含量最高。影响提取的主次因素为：乙醇体积分数＞功率＞微波时间。
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关键词 ：咖啡；绿原酸；高效液相色谱法；正交设计
中图分类号：Ｓ５７１．２文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）05－1146-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.030
收稿日期：２０１４－０７－１０
基金项目：２０１３年度江苏省高校自然科学研究面上项目（１３ＫＪＤ１８０００１）
作者简介：袁 俊（１９７２－），女，江苏南京人，副教授，博士，主要从事分子生物学、生物化学的教学和科研工作，（电话）１３９５１９７９９９０
（电子信箱）１４３９０３９＠ｑｑ．ｃｏｍ。
绿原酸又名３－咖啡酰奎尼酸，是植物在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径中间产物合成的一种苯丙素类物质［１］。绿原酸具有抗菌、消炎、解毒、利胆、降压等作用［２－４］，其在食品、医药和日用化工等领域中有着广泛的应用［５］。绿原酸作为一种具有多种生物活性的天然物质， 已引起国内外学者的广泛关注， 其提取纯化及检测技术的研发已成为当前研究的重点。但国内有关从咖啡中提取绿原酸的报道较少，大多数是从金银花、杜仲等材料中提取［６－８］。咖啡是世界三大饮品之一，所含活性成分绿原酸在咖啡豆中的含量占２％～８％［９，１０］。本试验主要采用正交分析的方法研究从咖啡中提取绿原酸，用高效液相色谱法测定该成分的含量，以期为从咖啡中有效提取绿原酸提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
试验所用咖啡豆为市售咖啡豆。绿原酸标准品、甲醇、乙醇为色谱纯；冰醋酸为分析纯。
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００型高效液相色谱仪（配有紫外检测器，美国安捷伦公司）；超声波发生器（宁波新芝生物科技有限公司）；ＡＵＹ１２０型电子天平（日本岛津公司）；５４１８Ｒ型冷冻离心机（德国艾本德公司）；ＨＨ－４型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。
１．２ 试验方法
１．２．１ 色谱条件 色谱柱为汉邦Ｈｅｄｅｒａ ＯＤＳ－２（４．６ ｍｍ×２５０ mm，５ μｍ），流动相为甲醇∶０．１％冰醋酸＝３０∶７０（V/V），流速为１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为３０ ℃，检测波长为３３０ ｎｍ，进样量为５ μＬ。
１．２．２ 标准溶液配制 精确称取对照品绿原酸４．００ ｍｇ，以甲醇溶解，并定容至５ ｍＬ棕色容量瓶中，得到０．８０ ｍｇ／ｍＬ的绿原酸标准溶液，备用。
１．２．３ 样品溶液配制 精确称取咖啡豆粉末０．５０ ｇ，采用水浸提法、水浸提＋微波辅助法、乙醇浸提法、乙醇浸提＋微波辅助法４种方法进行绿原酸提取工艺的比较，并对其正交试验影响因素和水平进行设定（表１～表４），以绿原酸含量为考察指标，确定最佳提取工艺和条件。
绿原酸含量＝Ｃ×Ｖ×Ｎ／Ｗ×１００％
式中，Ｃ为测量液总绿原酸浓度（ｍｇ／ｍＬ）；Ｖ为粗提液体积（ｍＬ）；Ｎ为稀释倍数；Ｗ为原料重量（ｍｇ）。
２ 结果与分析
２．１ 方法学考察
２．１．１ 线性关系考察 分别吸取绿原酸标准溶液，用甲醇稀释并在容量瓶中定容，使其浓度分别为０．０４、０．０８、０．２０、０．４０、０．６０、０．８０ ｍｇ／ｍＬ，按“１．２．１”的色谱条件测定绿原酸的峰面积，色谱图见图１ａ。以峰面积为纵坐标，绿原酸浓度为横坐标绘制标准曲线，得到绿原酸的标准曲线方程为Ｙ＝１４ ５２７Ｘ－３．３７７ ６（ｒ＝０．９９８ ７），表明在绿原酸浓度０．０４～０．８０ ｍｇ／ｍＬ的范围内线性关系良好。以咖啡豆粉末为研究对象分析其绿原酸的含量，色谱分析结果见图１ｂ。
２．１．２ 精密度考察 取绿原酸标准品溶液，连续进样６次，绿原酸保留时间的ＲＳＤ＝０．９８６％，绿原酸峰面积的ＲＳＤ＝１．０５４％，表明该液相色谱仪的精密度良好。
２．１．３ 稳定性考察 按样品溶液制备方法制样，制得的样品溶液在室温下放置０、４、８、１２、１６、２０ ｈ进行检测。结果表明，绿原酸保留时间的ＲＳＤ＝０．９２１％，峰面积的ＲＳＤ＝１．２３６％，表明该样品的稳定性良好。
２．１．４ 重复性考察 取咖啡样品，按供试样品溶液的制备方法得到６份溶液，精确吸取５ μＬ， 注入高效液相色谱仪检测。结果表明，绿原酸保留时间的ＲＳＤ＝０．７５３％，峰面积的ＲＳＤ＝１．５８９％，结果表明该方法的重复性良好。
２．１．５ 加标回收率试验 准确称量５份咖啡样品，按照样品中绿原酸含量的０．８、１．０和１．２倍加入对照样品，在“１．２．１”的色谱条件下进样５ μＬ分析，每个样品重复３次进样，按样品溶液制备方法制样，结果样品的平均回收率为９８．４３％，ＲＳＤ为２．３２％，表明该样品提取方法可行。
２．２ 正交试验结果
由表５可知，水浸提法提取咖啡中绿原酸的最佳条件为Ａ２Ｂ１Ｃ３，即浸提时间为５０ ｍｉｎ，温度为４０ ℃，料液比为１∶３０，在此条件下提取咖啡中绿原酸，含量为０．４９２％。各因素对绿原酸含量的影响大小顺序为料液比、浸提时间、温度。
由表６可知，水浸提＋微波辅助法提取咖啡中绿原酸的最佳条件为Ａ１Ｂ２Ｃ１，即微波时间为５ ｍｉｎ，功率为４００ Ｗ，料液比为１∶１０，在此条件下提取绿原酸，含量为０．３６２％。各因素对绿原酸提取率的影响大小顺序为微波功率、时间、料液比。
由表７可知，乙醇浸提法提取咖啡中绿原酸的最佳条件为Ａ２Ｂ１Ｃ２，即浸提时间为５０ ｍｉｎ，温度为４０ ℃，乙醇体积分数为６０％，在此条件下提取绿原酸，含量为０．３４８％。各因素对绿原酸含量的影响大小顺序为温度、乙醇体积分数、浸提时间。
由表８可知，乙醇浸提＋微波辅助法提取咖啡中绿原酸的最佳条件为Ａ１Ｂ１Ｃ２，即微波时间为５ ｍｉｎ，功率为３００ Ｗ，乙醇体积分数为６０％，在此条件下提取绿原酸，含量为１．３０４％。各因素对绿原酸含量的影响大小顺序为乙醇体积分数、微波功率、时间。
３ 讨论
微波提取技术具有快速简便、高效、不易破坏天然活性成分等优点。由于微波辐射对吸收介质有瞬时加热的特性，密封容器有与外界隔绝和增温增压的作用，故利用微波浸提技术，可使样品在很短时间内得以较完全的浸提［１１］。本研究中采用高效液相色谱法分析从咖啡中提取绿原酸的４种方法，结果表明最佳提取工艺为乙醇浸提＋微波辅助法，最佳提取条件为微波时间５ ｍｉｎ，功率３００ Ｗ，乙醇体积分数６０％，此条件下提取到的绿原酸含量最高。影响提取的主次因素为乙醇体积分数、功率、微波时间。本研究为从咖啡中提取绿原酸提供了一种高效、节能的新型提取工艺，为更加广泛及合理地利用丰富的资源，大力开展绿原酸的提取、纯化与绿原酸产品的开发研究提供了一些理论依据。
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（责任编辑 赵娟）