蔡振政１，刘小娟２，王 娟１，刘显良１，章松柏１，２
（１．长江大学农学院，湖北 荆州 ４３４０２５；２．福建农林大学植物病毒研究所，福州 ３５０００２）
摘要：褐飞虱（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ Ｓｔａｌ）可携带多种病毒，其中褐飞虱呼肠孤病毒（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ ｒｅｏｖｉｒｕｓ， ＮＬＲＶ）和水稻锯齿叶矮缩病毒（Ｒｉｃｅ ｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ，ＲＲＳＶ）均为ｄｓＲＮＡ基因组的呼肠孤病毒。通过接种、ｄｓＲＮＡ小量提取及ＲＴ－ＰＣＲ等方法分析ＮＬＲＶ对ＲＲＳＶ传播和增殖的影响，初步探讨这两种呼肠孤病毒之间的关系。结果表明，褐飞虱携带ＮＬＲＶ比率高低影响褐飞虱接种ＲＲＳＶ效率；携带ＮＬＲＶ的褐飞虱种群接种ＲＲＳＶ后两种病毒的含量差异较大，ＮＬＲＶ的含量远远大于ＲＲＳＶ的含量，推测褐飞虱体内的ＮＬＲＶ某种程度上干扰了ＲＲＳＶ的传播和增殖。
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关键词 ：ｄｓＲＮＡ病毒；褐飞虱呼肠孤病毒；水稻锯齿叶矮缩病毒
中图分类号：Ｓ４３２．１ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）05－1090-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.015
收稿日期：２０１４－０６－０６
基金项目：长江大学大学生创新创业训练计划项目（２０１３０２２）；国家自然科学基金青年基金项目（３１３０１６３８）
作者简介：蔡振政（１９９２－），男，广东韶关人，在读本科生，研究方向为植物保护，（电子信箱）１６４３９７９５２＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，章松柏（１９７８－），男，湖北黄梅人，讲师，博士，主要从事植物病毒监测和分子病毒学的研究，（电话）１８９７２３６１６３５（电子信箱）ｙａｎｇｔｚｅ２００８＠１２６．ｃｏｍ。
病毒学研究往往多集中在单一病毒的诸多特性方面，对寄主或介体体内病毒与病毒之间，病毒与其它生物之间的复合感染以及复合感染所引起的生物学现象关注较少［１，２］。越来越多的证据显示病毒的复合感染是一种极其普遍的现象［３］。病毒的复合感染可以减轻或加重某种病害的发生，这主要取决于病毒之间的协同或拮抗或竞争等关系［４－７］，根据这种关系可以解释病害加重或减轻发生的原因，从而采取相应措施控制病害的发生［８］。褐飞虱（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ Ｓｔａｌ）也可以携带多种病毒，其中褐飞虱呼肠孤病毒（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ ｒｅｏｖｉｒｕｓ，ＮＬＲＶ）和水稻锯齿叶矮缩病毒（Ｒｉｃｅ ｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ，ＲＲＳＶ）均为ｄｓＲＮＡ基因组的呼肠孤病毒［９］。ＮＬＲＶ是斐济病毒属（Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ）成员，可以经卵传播给后代，同时还可以通过水稻传染给不带毒的褐飞虱，但病毒在水稻内不复制［１０－１２］；ＲＲＳＶ是水稻病毒属（Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ）的成员，由褐飞虱持久性携卵而引发水稻锯齿叶矮缩病，并随着褐飞虱的长距离迁飞而传播扩散［１３－１８］，两种病毒之间的关系未知。与褐飞虱一样，白背飞虱也是南方稻区最重要的稻飞虱之一，危害水稻和传播水稻病毒（南方水稻黑条矮缩病毒，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＳＲＢＳＤＶ）。但白背飞虱携带和传播ＳＲＢＳＤＶ的效率极高［１９，２０］，这可能是ＳＲＢＳＤＶ易造成爆发和大面积流行的原因之一；而褐飞虱携带和传播ＲＲＳＶ的效率都较低，因此推测可能是水稻锯齿叶矮缩病一直仅限于局部地区流行的原因之一。导致褐飞虱携带和传播ＲＲＳＶ效率都较低的原因及与ＮＬＲＶ等病毒的关系一直是研究者比较感兴趣的问题。基于此，通过接种、ｄｓＲＮＡ小量提取和ＲＴ－ＰＣＲ等方法，初步研究ＮＬＲＶ对ＲＲＳＶ传播和增殖的影响，为深入研究这两种病毒间的关系奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
植物材料：水稻锯齿叶矮缩病病株于２０１０年采集于福建省龙岩市发病田间，鉴定后隔离种植；接种水稻品种为水稻锯齿叶矮缩病感病品种Ⅱ优航２号。
昆虫介体：褐飞虱群体２０１０年采集于福建福州市郊区无水稻锯齿叶矮缩病发生的田块，并经过鉴定后于实验室网箱中饲养。
１．２ 生物学接种
１．２．１ 褐飞虱饲毒 采用两种饲毒ＲＲＳＶ的方法。第一种方法是抓取网箱中饲养的二龄若虫于病株上饲毒，第二种方法是模拟自然条件下，抓取网箱中饲养的雌性褐飞虱成虫在病株上产卵，卵孵化成若虫后直接在病株上饲毒。饲毒后的介体度过循回期（２９ ℃下循回期平均为７．６ ｄ［２１，２２］）备用。
１．２．２ 单管单苗接种 选择饲毒后度过循回期的褐飞虱成虫（每种方法４０头，重复３次）进行单虫单管单苗生物学接种，接种水稻苗处于２叶１心期（下同），传毒８ ｄ，然后将传毒成虫低温保存，接种苗每２４ ｈ换一次，接种苗按编号种植于防虫温室内。
１．３ 快速小量提取ｄｓＲＮＡ
介体昆虫体内的ｄｓＲＮＡ参照食用菌病毒ｄｓＲＮＡ的提取［２３］。方法如下：选用褐飞虱１００～２００头，用液氮研磨成粉末；加入０．７ ｍＬ ２×ＳＴＥ和０．７ ｍＬ酚／氯仿／异戊醇（２５∶２４∶１）抽提处理，离心后取上清液，将上清液配制成含１７％乙醇的溶液；注入含１７％乙醇的１×ＳＴＥ溶液平衡过的纤维素（ＣＦ－１１）中，充分混匀，离心后去上清，再用含１７％乙醇的１×ＳＴＥ溶液反复洗涤３～４次；最后用不含乙醇的１×ＳＴＥ洗脱，洗脱液经过异丙醇沉淀和７５％乙醇漂洗，沉淀即为ｄｓＲＮＡ，干燥后溶于ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ的水中。ｄｓＲＮＡ产物经１％琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后ＢｉｏＲａｄ凝胶成像系统观察记录。
１．４ ＲＴ－ＰＣＲ法检测褐飞虱介体带毒率
取传毒后低温保存的成虫各２４头，用ＲＴ－ＰＣＲ法检测褐飞虱携带两种病毒的情况，ＲＲＳＶ和ＮＬＲＶ两种病毒的ｄｓＲＮＡ作为阳性对照。ＲＲＳＶ的检测引物为Ｐ９Ｆ／Ｐ９Ｒ（Ｐ９Ｆ：５′－ＡＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡ
ＧＡ－３′，Ｐ９Ｒ：５′－ＣＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧ ＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡ－３′），根据泰国分离物Ｓ９片段（ＮＣ＿００３７５７）设计，扩增片段大小为１ ０１７ ｂｐ；ＮＬＲＶ的检测引物为Ｎ８Ｆ/Ｒ（Ｎ８Ｆ：５′－ＡＡＴＣＡＣＴＣＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡ ＴＧＧＡＣＧ－３′，Ｎ８Ｒ：５′－ＣＴＡＣＣＡＡＣＣＣＡＧＴＣＧＧＴＣＣＴＴＣＡＡＡＴＡ－３′），根据已发表的ＮＬＲＶ Ｓ８的序列，扩增片段大小为５６０ ｂｐ［２４］。单头褐飞虱总ＲＮＡ采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒（北京天根）提取，参照说明进行，最后用２０ μＬ的无核酸酶灭菌水溶解。反转录按照反转录试剂盒（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）说明进行操作。ＰＣＲ反应体系按照ＴａＫａＲａ的ｒＴａｑ酶使用说明进行，反应程序为：９４ ℃变性４ ｍｉｎ，３５个循环的扩增（９４ ℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ４５ ｓ），最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，产物经１％琼脂糖凝胶电泳，ＥＢ染色后ＢｉｏＲａｄ凝胶成像系统观察记录。
２ 结果与分析
２．１ 生物学接种结果
两种饲毒方法获得的褐飞虱成虫单管单苗生物学接种结果见表１。从表１中得出，能够传毒的褐飞虱成虫分别占试验成虫总数的２２．５0％、５０.00％；生物学接种３２０株水稻分别有２４株、４４株发病，发病率为７．５0％、１３．７５％。
２．２ 褐飞虱体内ｄｓＲＮＡ的提取和检测结果
收集接种ＲＲＳＶ和未接种ＲＲＳＶ的褐飞虱种群，提取并检测褐飞虱种群体内的ｄｓＲＮＡ情况，以协助了解介体体内的带毒情况以及ｄｓＲＮＡ病毒种类。经过反复试验，从褐飞虱体内提取ｄｓＲＮＡ以０．２~０．３ ｇ为宜（１００~２００头）。图１是褐飞虱（１００－２００头）体内的ｄｓＲＮＡ，从其ｄｓＲＮＡ基因图谱中可清晰地看到褐飞虱体内存在ＮＬＲＶ，饲毒ＲＲＳＶ后体内的病毒除了ＮＬＲＶ外，还有ＲＲＳＶ，但两种病毒的含量差别较大，ＮＬＲＶ含量远大于ＲＲＳＶ。
２．３ 褐飞虱介体带毒率
由图２可知，在方法１和方法２中，２４头成虫中携带ＲＲＳＶ分别有１３头和１８头，带毒率分别为５４．１7％、７５．００％，带毒率差异较大；而携带ＮＬＶＲ分别为２３头、２４头，带毒率分别为９５．８３％、１００．００％，带毒率差异较小。
３ 小结与讨论
生物学接种试验和褐飞虱带毒率检测结果表明，在方法１中，使用二龄若虫饲毒ＲＲＳＶ，度过循回期后成虫带毒率为５４．１７％，带毒且能够传毒的成虫为４２．８５％，这些数据与以往报道的数据相符合［１３，２１，２５，２６］；在方法２中，模拟自然条件下在病株上产卵、饲毒和度过循回期后，带毒率较高，成虫带毒率约为７５％，带毒且能够传毒的成虫约为５０％，这些数据皆比以往报道的数据高一些［１３，２１，２５，２６］。两种方法不同点之处在于饲毒ＲＲＳＶ时褐飞虱携带ＮＬＲＶ的差异。ＮＬＲＶ可以经卵传播，经卵传播比率为１５％［１０，１２］，在方法１中，卵孵化成若虫后携带ＮＬＲＶ的比率低于１５％，多数介体首先接种的是ＲＲＳＶ；而室内饲养的褐飞虱种群带毒率一般都在９０％以上［１０，２４］。在方法２中，二龄褐飞虱若虫在饲毒ＲＲＳＶ之前多数都携带了ＮＬＲＶ。因此，根据生物学接种和褐飞虱带毒率检测结果初步推测ＮＬＲＶ能在一定程度上影响褐飞虱生物学接种ＲＲＳＶ以及褐飞虱的传毒效率。此外，ＮＬＲＶ和ＲＲＳＶ都是褐飞虱体内增殖性病毒［１２，１５］，但两者同时存在时，ＮＬＲＶ的含量远远大于ＲＲＳＶ（如图２），这也说明ＮＬＲＶ可能某种程度上干扰了ＲＲＳＶ在体内的增殖。褐飞虱是一种典型的迁飞性害虫，每年春季或夏季由南向北迁移、秋季由北向南回迁，在中国境内分布范围几乎覆盖全境，褐飞虱一旦带毒，则可以将水稻锯齿叶矮缩病毒传进迁入地区［１３，１４，１６－１８］。水稻锯齿叶矮缩病首先发现于菲律宾和印度尼西亚，并于２０世纪７０年代末在日本、印度及东南亚一些国家局部地区引起水稻大面积减产［１３－１５］；在中国该病自１９７８年以来，先后在台湾、福建、广东和江西等省发生流行，对水稻生产造成了一定的影响［１５，２１，２５］。但相对于白背飞虱传播的水稻南方黑条矮缩病毒病等大面积流行病害来说，水稻锯齿叶矮缩病一直仅限于局部地区流行，危害程度远不及水稻南方黑条矮缩病毒病［２０，２７］，具体原因鲜见报道。本研究发现ＮＬＲＶ可能某种程度上干扰了ＲＲＳＶ在褐飞虱体内的增殖以及传播，从病毒与病毒之间的拮抗方面初步分析了ＮＬＲＶ的存在可以减轻水稻锯齿叶矮缩病的发生和流行，从某种程度上解释了水稻锯齿叶矮缩病一直仅限于局部地区流行的现象。
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（责任编辑 张毅）