方正武，马东方
（长江大学农学院，湖北 荆州 ４３４０２５）
摘要：普通小麦－簇毛麦易位系Ｖ８３６０具有抗逆性强、抗条锈性强和抗白粉性强等许多优良的生物学特性。用９个中国目前流行的条锈菌生理小种对Ｖ８３６０进行了抗条锈性评价，表明该易位系具有良好的抗条锈性。以条锈菌小种ＣＹＲ３２对Ｖ８３６０与感病品种铭贤１６９配置的Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３和ＢＣ１代进行苗期抗条锈性遗传分析，并对其中一个Ｆ２代群体进行了ＳＳＲ标记。结果表明，Ｖ８３６０对条锈菌ＣＹＲ３２的抗病性由１对显性核基因控制，暂命名为ＹｒＶ８３６０。从３２９对ＳＳＲ引物中筛选到位于小麦４ＡＬ染色体上的４个ＳＳＲ位点Ｘｗｍｃ１６１、Ｘｇｗｍ５６５、Ｘｇｗｍ４９４和Ｘｃｆｄ２５７与该基因连锁。
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关键词 ：普通小麦－簇毛麦易位系； 抗病基因； 遗传分析； ＳＳＲ标记
中图分类号：Ｓ５１２．１０３．５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０５－１０４２－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０５．００５
收稿日期：２０１４－１２－１６
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１３０３００８）；湖北省重点（优势）学科作物学（长江大学）资助项目
作者简介：方正武（1977-），男，江西上饶人，博士，主要从事小麦遗传育种，（电话）１３７９７３２９３３９（电子信箱）Ｆａｎｇｚｈｅｎｇｗｕ８８＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，
马东方，男，山东滕州人，讲师，主要从事小麦抗条锈病机制研究，（电子信箱）ｍａｄｏｎｇｆａｎｇ１９８４＠１６３．ｃｏｍ。
由条形柄锈菌小麦专化型（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ． ｓｐ． ｔｒｉｔｉｃｉ）引起的小麦条锈病是世界各主要麦区的重要病害之一［１］。而且小麦条锈病在中国分布范围较广，主要集中在西北、西南、黄淮海等冬麦区以及西北春麦区。迄今，小麦条锈病发生的８次大面积的暴发流行给中国小麦生产带来巨大损失［２，３］。由于抗条锈品种的单一化种植，加速了条锈菌毒性结构的变异，加速了小麦主栽品种抗条锈性的丧失。虽然农药（粉锈宁等）的大面积及时使用可以控制该病害，但要投入大量的人力、物力、财力，而且容易造成污染环境。大量国内外实践表明，种植抗病品种是防治小麦条锈病最有效、经济和环保的措施［４］。因此，引进、鉴定、筛选有效的抗条锈种质资源，挖掘其中的抗病基因，对实现小麦抗条锈基因多样化，培育持久抗条锈病小麦品种十分必要［５］。
随着分子生物学的发展和基因分子作图技术的日益完善，目前已发展了多种以ＤＮＡ为基础的分子标记技术，如ＳＳＲ、ＲＧＡＰ、ＳＮＰ、ＡＦＬＰ等。简单重复序列（Sｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）分子标记被广泛应用于种质资源鉴定、物种进化、基因的分子作图等研究。目前，利用ＳＳＲ方法已将许多小麦条锈病抗病性基因定位，大部分已正式命名的小麦抗条锈病基因均已获得与其紧密连锁的ＳＳＲ标记［６］。
因对小麦条锈病、白粉病、全蚀病等病害具有良好抗性，同时分蘖能力强、耐干旱、耐盐碱等优良性状，簇毛麦（Ｈａｙｎａｌｄｉａ ｖｉｌｌｏｓａ，２ｎ＝１４）近年来已引起众多育种工作者的关注［７，８］。傅杰等［９］通过普通小麦与簇毛麦杂交选育出一系列易位系、代换系和附加系，为利用这一种质资源提供了试验材料。井金学等［１０］研究发现，簇毛麦的抗锈基因具有较强的传递性，可转移至普通小麦中。本研究旨在对普通小麦－簇毛麦易位系Ｖ８３６０进行抗条锈性鉴定，明确Ｖ８３６０的抗条锈病遗传规律，挖掘其抗病基因，加快对这一种质资源的利用。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
小麦材料为普通小麦－簇毛麦易位系Ｖ８３６０、感病对照为铭贤１６９、簇毛麦、白粒高３８、普通小麦“７１８２”、Ｖ８３６０与铭贤１６９杂交后代Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、ＢＣ１群体，其中Ｖ８３６０是由簇毛麦与白粒高３８、普通小麦“７１８２”杂交选育而成。小麦条锈菌生理小种（致病类型）为ＣＹＲ２７、ＣＹＲ２８、ＣＹＲ２９、ＣＹＲ３０、ＣＹＲ３１、ＣＹＲ３２、ＣＹＲ３３、Ｓｕ１１－７、Ｓｕ１１－１１。
１．２ 苗期抗条锈病遗传分析
将亲本、Ｆ１、Ｆ２、ＢＣ１Ｆ１以及Ｆ３家系种植于直径为２０ ｃｍ的花盆中，置于温室按常规方法培养。在供试小麦幼苗生长至二叶期时，用涂抹法接种小麦条锈菌。接种完成后，将小麦幼苗置于黑暗的保湿箱中２４ h。之后转入温室内潜育发病，温度为１５～１７ ℃（昼）／１０～１２ ℃（夜），光照周期１６ ｈ（昼）／８ ｈ（夜）。反应型调查标准分为１１级，即０、０；、０；＋、１、１＋、２、２＋、３-、３、３＋、４。０～２＋为抗病，３-～４为感病［１１］。统计双亲、杂交后代各株系的抗感分离比例，用卡方检验法对期望比例进行检测。
１．３ 基因组ＤＮＡ的提取和抗、感池的构建
基因组ＤＮＡ提取用ＣＴＡＢ法［１２］稍作改进。参考Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ等［１３］提出的抗病池、感病池建立方法，挑选Ｆ２代的１０株高抗单株ＤＮＡ、１０株高感单株ＤＮＡ分别等量混合构成抗病池（ＢＲ）和感病池（ＢＳ）。构建抗感池的单株均经过Ｆ３家系验证其对应Ｆ２代单株的纯合性。
１．４ ＳＳＲ标记筛选和遗传作图
根据Ｒ？觟ｄｅｒ等［１４］和ｈｔｔｐ：／／ｗｈｅａｔ．ｐｗ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ公布的小麦染色体上ＳＳＲ引物序列信息，由上海Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生命技术公司合成ＰＣＲ引物。以Ｖ８３６０、铭贤１６９、抗病基因池、感病基因池和Ｆ２代群体的ＤＮＡ为模板进行扩增。扩增产物用８％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显影。筛选与抗病亲本相关的ＳＳＲ标记，进而用Ｍａｐ Ｍａｒｋｅｒ ３．０ｂ软件计算各标记位点与目的基因的遗传距离，最后用Ｍａｐ Ｄｒａｗ Ｖ２．０软件绘制连锁图［１５］。
２ 结果与分析
２．１ 苗期抗条锈性鉴定结果
Ｖ８３６０和簇毛麦对ＣＹＲ２７、ＣＹＲ２８、ＣＹＲ２９、ＣＹＲ３０、ＣＹＲ３１、ＣＹＲ３２、ＣＹＲ３３、Ｓｕ１１－７、Ｓｕ１１－１１等９个条锈菌生理小种表现良好的抗锈性。感病对照品种铭贤１６９、白粒高３８、“７１８２”对９个条锈菌均表现高度感病反应（表１）。说明Ｖ８３６０是一个优良的抗条锈病种质资源。
２．２ 抗条锈性遗传分析
接种ＣＹＲ３２时，Ｖ８３６０与铭贤１６９杂交的Ｆ１代与抗病亲本一样呈抗病反应，ＢＣ１代抗病与感病株数比为１０∶９，经卡方检验符合１∶１的分离比；反交组合Ｆ２－１中，抗病植株１８２株，感病植株５６株，符合３∶１的分离比例。２３８株Ｆ２单株共收获２３２个Ｆ２∶３家系。对应的Ｆ２∶３家系中，纯抗家系６３个，抗感分离家系１１４个，纯感家系５５个，分离比例符合１∶２∶１；正交组合Ｆ1－２中，抗病植株１５０株，感病植株４８株，符合３∶１的分离比例（表２）。
上述结果表明Ｖ８３６０对ＣＹＲ３２的抗病性由１对显性细胞核基因控制，暂命名为ＹｒＶ８３６０。以Ｆ２－１群体的２３８个单株构建作图群体，对抗条锈病基因进行ＳＳＲ标记。
２．3 ＹｒＶ８３６０的ＳＳＲ标记定位
选择分布于小麦２１条染色体上的３２９对ＳＳＲ引物对抗病材料Ｖ８３６０、感病材料铭贤１６９、抗病池及感病池进行多态性筛选。结果４ＡＬ上的引物Ｘｗｍｃ１６１、Ｘｇｗｍ５６５、Ｘｇｗｍ４９４和Ｘｃｆｄ２５７在Ｖ８３６０、铭贤１６９及抗感池间同时扩增出稳定的多态性片段。对Ｆ２代群体进行单株扩增，结果大部分抗病单株扩增出与抗病亲本Ｖ８３６０相同的带型（Ａ）或双亲的组合带型（Ｈ），而大部分感病单株则扩增出与铭贤１６９一致的带型（Ｂ），由此推测这４个位点与ＹｒＶ８３６０连锁。
２．4 连锁遗传分析
根据Ｆ２分离群体及Ｆ２∶３家系反应型，确定Ｆ２单株的抗感基因型。由Ｆ２所有单株的ＰＣＲ扩增统计结果可以得出，Ｘｗｍｃ１６１、Ｘｇｗｍ５６５、Ｘｇｗｍ４９４和Ｘｃｆｄ２５７的扩增位点与ＹｒＶ８３６０有明显的连锁关系 （表３）。
用Ｍａｐ Mａｋｅｒ ３．０ｂ软件进行连锁分析，ＬＯＤ值设置为３．０，结果显示Ｘｗｍｃ１６１、Ｘｇｗｍ５６５、Ｘｇｗｍ４９４和Ｘｃｆｄ２５７与抗条锈基因的遗传距离分别为８．６、３．４、４．３和７．５ ｃＭ。参照已报道的小麦遗传图谱［１６］，根据抗条锈病基因与所获得标记之间的连锁关系可知，ＹｒＶ８３６０位于小麦染色体４ＡＬ上，且位于Ｘｇｗｍ５６５和Ｘｇｗｍｂ４９４之间。据此绘制了ＹｒＶ８３６０遗传连锁图（图１）。
３ 讨论
发掘和鉴定抗条锈病基因是小麦抗病育种的重要工作。开展小麦抗条锈病基因的分子标记研究，一方面通过寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记，在基因型水平上对作物种质资源进行深入评价和鉴定。另一方面为通过分子标记辅助选择实现多种基因的累加，培育出多抗或广谱的种质或品种奠定基础。
普通小麦－簇毛麦易位系Ｖ８３６０具有抗条锈病、白粉病等较强抗性以及多种优良农艺性状。本研究发现普通小麦－簇毛麦易位系Ｖ８３６０对中国优势条锈菌小种ＣＹＲ３２具有良好的抗病性，且抗性由１对显性核基因ＹｒＶ８３６０控制，被定位在４ＡＬ上。
目前，正式命名的６２个抗条锈病基因只有Ｙｒ５１定位在４ＡＬ上［17，１８］。从染色体位置上分析，Ｙｒ５１位于染色体长臂末端，而ＹｒＶ８３６０位于染色体长臂中间部位，Ｙｒ５１与ＹｒＶ８３６０的距离大约为３２．３ ｃＭ。从系谱上分析，Ｙｒ５１的载体品种ＡＵＳ２７８５８是澳大利亚的农家品种，而ＹｒＶ８３６０由中国育种工作者自主选育而成，Ｖ８３６０与ＡＵＳ２７８５８的系谱并无交集。周新力等［１９］研究发现，普通小麦－簇毛麦易位系Ｖ９１２８－１对ＣＹＲ３０的抗条锈病基因ＹｒＶ１位于小麦染色体３ＢＳ上；侯璐等［２０］报道，易位系Ｖ９１２８－３对Ｓｕ１１－４的抗条锈病基因ＹｒＨＶ位于染色体２ＡＬ；王睿等［２１］把易位系Ｖ９１２５－２对ＣＹＲ２９的抗条锈病基因ＹｒＷＶ定位于染色体７ＤＳＳ上。因此可以初步断定，ＹｒＶ８３６６０不同于普通小麦－簇毛麦易位系Ｖ９１２８－１、Ｖ９１２８－３和Ｖ９１２５－２中的抗锈基因。综合上述分析，初步判断ＹｒＶ８３６０很可能是一个不同于已知抗条锈病基因的新基因。
在目前大量抗源和主栽品种对中国目前流行条锈病生理小种ＣＹ３２丧失抗病性的形势下，本研究发现的抗病基因ＹｒＶ８３６０对抗病育种显得尤为宝贵。Ｖ８３６０综合农艺性状较好，对小麦条锈病又具有良好的抗性，稍加改良就可以用于生产。
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（责任编辑 郑威）