付素静，王 岚，杨小玲，吴衍昭
（铜仁学院生物与农林工程学院／梵净山野生动植物资源保护与利用研究中心／梵净山特色动植物资源重点实验室，
贵州 铜仁 ５５４３００）
摘要：为了探索梵净山野生蝴蝶花（Ｉｒｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）总黄酮的最佳提取工艺条件，采用单因素和正交试验方法，以料液比（ｇ∶ｍＬ）、乙醇体积分数、浸提温度和提取时间４个因素进行试验。结果表明，梵净山蝴蝶花总黄酮提取的最适宜工艺条件为料液比１∶３０，以９０％乙醇为提取溶剂，浸提温度８０ ℃，超声波提取４０ ｍｉｎ，该条件下蝴蝶花总黄酮提取率为４．２９％。该工艺可为梵净山蝴蝶花的综合利用提供科学依据和技术支持。
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关键词 ：蝴蝶花（Ｉｒｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）；总黄酮；工艺优化
中图分类号：Ｒ２８４．２；Ｓ６８１．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０６－１４５8－０３
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０６．０４５
Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Extracting Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ from Ｗｉｌｄ Ｉｒｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ
in Ｆａｎｊｉｎｇ Ｍｏｕｎｔａｉｎ
ＦＵ Ｓｕ－ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｌａｎ，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌｉｎｇ，ＷＵ Ｙａｎ－ｚｈａｏ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａ＆Ｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ／Ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ Ｆａｎｊｉｎｇ Ｍｏｕｎｔａｉｎ／ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ａｎｉｍａｌ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｉｎ Ｆａｎｊｉｎｇ Ｍｏｕｎｔａｉｎ， Ｔｏｎｇｒｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｏｎｇｒｅｎ ５５４３００， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ extracting ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｉｒｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ ｉｎ Ｆａｎｊｉｎｇ ｍｏｕｎｔａｉｎ ｗａｓ optimized with ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ. Tｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ， ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔs ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ optimal conditions of extracting total ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｉ． ｊａｐｏｎｉｃａ were ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶３０（ｇ∶ｍＬ）， ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ， ４０ ｍｉｎ， ８０ ℃． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ of ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ was ４．２９％． It will provide ｖａｌｕａｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅly ｕｔｉｌｉｚing ｏｆ Ｉ． ｊａｐｏｎｉｃａ ｉｎ Ｆａｎｊｉｎｇ ｍｏｕｎｔａｉｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｉｒｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
收稿日期：２０１４－１２－１６
基金项目：贵州省铜仁市科技局项目［铜市科研（２０１４）４０－１３］；贵州省野生动植物保护与利用重点支持学科建设项目［黔教合重点
支持学科字（２０１１）２３２号］；梵净山特色动植物资源重点实验室资助项目［黔教合ＫＹ（２０１１）００５号］
作者简介：付素静（１９８０－），女，贵州思南人，副教授，硕士，主要从事花卉学、园林植物开发利用及相关科研工作，（电话）１８３８５９７４００９
（电子信箱）ｆｕｓｕｊｉｎｇ＿９９７３＠１６３．ｃｏｍ。
蝴蝶花（Ｉｒｉｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）是鸢尾科鸢尾属多年生草本植物。根茎匍匐状，有长分枝，具有清热解毒、消肿止痛的功效且有小毒［１］。根状茎在民间作为土药长期使用，主要用于治疗肝炎、食积胀满、咽喉肿痛、跌打损伤、子宫脱垂和蛇犬咬伤等［２］。蝴蝶花作为民族医药，主要用于治疗肝气郁结［３，４］。目前，对蝴蝶花的研究主要集中在生物学特性［５，６］、异黄酮的提取［７］、园林应用［８，９］、病虫害［１０］、花形态可塑性［１１］和组织培养［１２］等方面。在化学成分的研究上，对同属植物射干的鸢尾苷、鸢尾酮和异黄酮的研究较多［１３－１５］，有学者对蝴蝶花的鸢尾苷和鸢尾酮进行了研究［１６，１７］。蝴蝶花在贵州省产量较大，山上各处均有野生植株，而且药用价值大，为进一步开发利用其种质资源，本试验首次对蝴蝶花的总黄酮提取工艺进行了优化，旨在为蝴蝶花资源的综合开发和利用提供理论基础和技术支持。
１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂
１．１．１ 材料 采自梵净山保护区周边，经鉴定为蝴蝶花。将材料洗净、置于７０ ℃烘箱干燥，粉碎，过６０目筛，待用。
１．１．２ 试剂 芦丁，天津市光复精细化工有限公司；氢氧化钠，天津石英钟厂霸州市化工分厂；硝酸铝，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；亚硝酸钠，成都金山化学试剂有限公司；无水乙醇，天津市富宇精细化工有限公司。以上试剂均为国产分析纯。
１．１．３ 仪器设备 ８０－２型离心机，江苏金坛市中大仪器厂；ＤＨＧ－９１４０Ａ型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；ＡＲ１２４ＣＮ型电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；ＳＧ５２００ＨＰＴ型台式超声波清洗器，上海冠特超声仪器有限公司；Ｔ６型新世纪紫外可见分光光度计，北京谱析通用仪器有限公司。
１．２ 方法
１．２．１ 样品提取 称取样品粉末０．５００ ０ ｇ于１００ ｍＬ三角瓶中，以一定体积分数的乙醇作为浸提试剂，在一定温度下进行超声波浸提３０ ｍｉｎ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，上清液转入１００ ｍＬ容量瓶，加入０．０５ ｇ／ｍＬ亚硝酸钠０．４ ｍＬ，放置６ ｍｉｎ，加入０．１ ｇ／ｍＬ硝酸铝０．４ ｍＬ，放置６ ｍｉｎ，再加０．０４ ｇ／ｍＬ氢氧化钠４ ｍＬ，用去离子水定容至刻度，摇匀，放置１５ ｍｉｎ后，在分光光度计５１０ ｎｍ波长下测定吸光度［１８］。
１．２．２ 标准曲线的绘制 以芦丁为标准品，采用蒽酮比色法测定总黄酮含量［１９］，标准曲线见图１。标准曲线方程为ｙ＝０．０１５ ８ｘ－０．０００ ７，Ｒ２＝０．９９９ １。
１．２．３ 提取条件的优化 精确称取蝴蝶花粉末０．５００ ０ ｇ若干份，考察料液比（ｇ∶ｍＬ，下同）分别为１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０、１∶３５；乙醇体积分数分别为４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％；浸提温度分别为４０、５０、６０、７０、８０ ℃；提取时间分别为１０、２０、３０、４０、５０ ｍｉｎ对总黄酮提取率的影响，采用Ｌ９（３４）进行正交试验，通过正交分析得出总黄酮最佳提取工艺参数。正交试验因素与水平见表１。
２ 结果与分析
２．１ 单因素试验结果
２．１．１ 料液比 不同料液比对总黄酮提取率的影响见图2。由图2可知，当料液比为１∶１０时，总黄酮提取率最低（１．１４％）；随着料液比的降低，总黄酮的提取率呈持续上升的趋势，当料液比为１∶３０时，提取率最高（２．３９％），原因可能是料液比的降低增大了传质动力。当料液比低于１∶３５时，蝴蝶花的总黄酮提取率呈下降趋势，可能是由于料液比的降低反而不利于总黄酮的充分浸出。所以，最适料液比是１∶３０。
２．１．２ 乙醇体积分数 不同乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响见图3。由图3可知，当乙醇体积分数为４０％时，蝴蝶花总黄酮的提取率最低（１．５５％）；随着乙醇体积分数的增大，总黄酮提取率呈持续上升的趋势。当乙醇体积分数为８０％时，提取率最高（３．７４％）；当乙醇体积分数为９０％时，蝴蝶花总黄酮的提取率下降。因此８０％乙醇是最佳的提取溶剂。
２．１．３ 浸提温度 不同浸提温度对总黄酮提取率的影响见图4。由图4可知，当浸提温度为４０ ℃时，蝴蝶花总黄酮的提取率为２．７９％；当温度为５０ ℃时，总黄酮的提取率下降为２．５８％，具体原因有待进一步研究。随着温度的继续升高，蝴蝶花总黄酮的提取率又呈上升趋势。当温度为７０ ℃时，总黄酮的提取率最高（３．５５％），说明温度的升高，对细胞的破坏作用变大，这样有利于总黄酮的浸出。当浸提温度超过７０ ℃时，总黄酮的提取率下降，可能是由于温度过高，总黄酮的活性和结构发生了变化，导致总黄酮部分分解，造成提取率下降。所以最适宜的浸提温度为７０ ℃。
２．１．４ 提取时间 不同提取时间对总黄酮提取率的影响见图5。由图5可知，当提取时间为１０ ｍｉｎ时，总黄酮的提取率最低（2．16％）；随着提取时间的延长，蝴蝶花总黄酮的提取率呈上升趋势。当提取４０ ｍｉｎ时，总黄酮的提取率达到最大值（２．４５％），说明提取时间和总黄酮的提取率有着密切的关系，在提取４０ ｍｉｎ内，增加超声波时间，有利于总黄酮的溶解和扩散，但提取超过４０ ｍｉｎ后，蝴蝶花总黄酮的提取率呈下降趋势，可能是由于超声波时间过长，总黄酮部分分解，导致提取率下降。所以，最佳提取时间是４０ ｍｉｎ。
２．２ 正交试验结果
在单因素试验的基础上，选择料液比、乙醇体积分数、浸提温度和提取时间４个因素进行Ｌ９（３４）正交试验，试验结果见表２。由表２极差分析可知，４个因素对蝴蝶花总黄酮提取效果的影响依次为Ｄ、Ｃ、Ａ、Ｂ，即提取时间＞浸提温度＞料液比＞乙醇体积分数，最佳工艺组合为Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ２，即料液比为１∶３０， ９０％乙醇，浸提温度８０ ℃，超声波提取４０ ｍｉｎ。在此工艺条件下进行验证，总黄酮的提取率为４．２９％，高于正交组合Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ２的４．２６％，表明该方法可行。
３ 小结与讨论
梵净山蝴蝶花总黄酮提取工艺的４个因素中，提取时间的影响最大，浸提温度次之，乙醇体积分数的影响最小。本试验在最佳的工艺条件下总黄酮的提取率为４．２９％，与杨红玲等［２０］、李英娜等［２１］对射干黄酮提取的得率９．８４１％和７．２７％相比较低。经单因素和正交试验得出，提取梵净山蝴蝶花总黄酮的最佳工艺参数为料液比１∶３0、９０％乙醇、浸提温度８０ ℃，超声波提取４０ ｍｉｎ，此时总黄酮提取率为４．２９％。该工艺具有操作性强，稳定性好和成本较低等特点，可为梵净山野生蝴蝶花开发和利用提供理论技术支持。
本研究采用单因素和正交试验的方法，用芦丁作为标准品，用ＮａＮＯ２－Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＯＨ作显色剂，标准曲线方程Ｒ２＝０．９９９ １，线性关系良好，说明该工艺稳定性好。
本研究仅对乙醇体积分数、料液比、提取时间和浸提温度４个因素进行了初步试验，影响蝴蝶花总黄酮的提取率还有很多因素［２2］，如提取试剂、方法、次数和采收季节等，今后还需对这些因素进行综合分析和研究。蝴蝶花作为贵州民族医药，其化学成分研究尚未深入开展，究竟是哪些成分作为民族医药的药用成分发挥作用还是未知，今后还需进行深入研究。
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