周明亮1，杨平贵1，吴登俊2，张翔宇3
（1．四川省草原科学研究院，成都 611743；2．四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 625014;
3．四川省畜牧科学研究院，成都 611741）
摘要：试验以凉山半细毛羊为研究对象，采用RT－PCR方法克隆了其IGFBP－7基因的CDS全序列，生物信息学方法深入分析其序列。结果表明，凉山半细毛羊IGFBP－7基因的CDS序列为846 bp，编码282个氨基酸，与牛、人、鼠的CDS同源性分别为99％、95％、90％，氨基酸序列同源性分别为98％、93％、89％，GenBank登录号为FJ589640．1；IGFBP－7基因的氨基酸分子质量为29．0 ku，理论等电点（pI）为8．25；进化分析显示其与牛、山羊等哺乳动物关系较近，与斑马鱼、鲍等亲缘关系较远；IGFBP－7基因的蛋白质疏水性区域与亲水性区域间隔较为均匀分布，有1个信号肽、 2个跨膜区、16个磷酸化位点、 4个N－糖基化位点和1个O－糖基化位点；二级结构分析显示无规卷曲、α－螺旋和β－折叠区域分别为64．89％、19．86％、15．25％；三级结构分析显示存在IGFBP＿N和Ig－like功能域。该试验为进一步研究绵羊IGFBP－7基因的功能奠定了基础。
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关键词 ：绵羊；IGFBP－7基因；克隆；序列分析
中图分类号：S826；Q789 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1416-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.034
Cloning and Sequence Analysis of IGFBP－7 Gene in Sheep
ZHOU Ming－Liang1，YANG Ping－Gui1，WU Deng－Jun2，ZHANG Xiang－Yu3
（1． Sichuan Academy of Grassland Science， Chengdu 611743， China； 2．College of Animal Sci－Technology， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， Sichuan， China； 3． Sichuan Academy of Animal Science， Chengdu 611741， China）
Abstract： The whole CDS sequence of IGFBP－7 gene was cloned from Liangshan semi－fine wool sheep and sequenced with RT－PCR and bioinformatics． The results showed that the CDS sequence of IGFBP－7 gene was 846 bp， encoding 282 amino acids． Its CDS homology with bovine， human and rat was 99％， 95％ and 90％， respectively． The registry number in GenBank was FJ589640．1． Analysis of the amino acid sequence revealed that it was close to mammals such as cattle and sheep and far from Haliotis diversicolor， fish， etc． Its molecular weight was 29．0 ku， with the theoretical isoelectric point of 8．25． The hydrophobic and hydrophilic regions in IGFBP－7 gene distributed uniformly． It had a signal peptide， two transmembrane region，16 sites of phosphorylation， 4 sites of N－glycosylation and 1 sites of O－glycosylation． The analyses of secondary structure showed that the random coil， α－helix and β－sheet region were 64．89％，19．86％ and 15．25％， respectively． It had IGFBP＿N domain and a Ig－like domain． It will provide a scientific basis for further studying on the function of IGFBP－7 gene in sheep．
Key words： sheep；insulin growth factor binding protein－7 gene（IGFBP－7 gene）； clone； sequence analysis
收稿日期：2014-07－10
基金项目：农业部公益性行业科研专项（201003061）；四川省畜禽育种攻关项目（01NG029－18）
作者简介：周明亮（1976-），男，重庆合川人，副研究员，博士，主要从事藏绵羊遗传资源保护与利用，（电话）15928997436（电子信箱）
zhou760302@163．com；通信作者，吴登俊（1956-），男，四川名山人，教授，博士生导师，主要从事动物分子遗传育种研究，
（电话）0835－2885848（电子信箱）wdengjun@sicau．edu．cn。
胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP－7）是胰岛素样生长因子结合蛋白家族（IGFBPs）的成员之一，在不同物种的不同组织中发现，各自进行了命名，胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1（IGFBP－rP1）［1］、胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP－7）、MAC25［2］、肿瘤黏附因子（TAF）［3］和前列腺素刺激因子（PSE）［4］等都是同一种蛋白。在对其他物种的IGFBP－7的结构研究中发现，IGFBP－7有类似于IGFBP－1、IGFBP－2、IGFBP－3、IGFBP－4、IGFBP－5和IGFBP－6等高度保守的N端结构域，位于信号肽之后80～93个氨基酸残基区域［5］，IGFBP－7的N端还含有整个氨基酸序列的18～20个半胱氨酸（Cys）中的12个，是高度保守的半胱氨酸富含区域，N端偶数个Cys形成的二硫键有利于维持IGFBPs三级结构的稳定性［6］。
IGFBP－7基因的功能与IGFBP－1、IGFBP－2、IGFBP－3、IGFBP－4、IGFBP－5和IGFBP－6等基因一致，主要表现为IGF依赖和独立于IGF的作用，在IGF信号通路中，IGFBPs、IGFs和IGF－1R的信号传递过程通过丝氨酸/苏氨酸的磷酸化激活作用最终开启细胞内MAPK激酶途径和P13激酶途径，实现细胞外信号向细胞内转导，进而来调控细胞活性、细胞分化、细胞增殖、细胞分裂、细胞迁移及蛋白质合成的变化［5］。有关绵羊IGFBP－7基因的序列分析、单核苷酸多态性等报道较少。本研究以凉山半细毛羊为研究对象，克隆了其IGFBP－7基因的全CDS序列，利用生物信息学方法分析了CDS序列及相应的氨基酸序列，为进一步研究该基因在绵羊生长发育过程中的调控作用以及标记的辅助选择育种奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料
以四川省凉山州布拖县的凉山半细毛羊原种场的7～9月龄的凉山半细毛羊母羊为试验材料，采用颈静脉放血，宰杀后10 min内收集肝脏组织，浸泡于Sample Protector（宝生物）试剂中，置放于液氮中保存，带回实验室于－80 ℃冰箱中保存备用。
1．2 引物设计
参照NCBI GenBank数据库中公布的普通牛（Bos taurus）的IGFBP－7基因（NM＿001102300）的mRNA序列，采用Prime 5．0软件设计引物，Oligo 6．0进行引物评价，采用NCBI网站的Blast工具检索比对以验证引物特异性，IGFBP－7引物序列为F：5′－ACGCCATGGAGCGGCCGCTGC－3′，R：5′－TTA
CAGCTCAGCACCTTCACCTT－3′，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。
1．3 总RNA的提取
取凉山半细毛羊的肝脏组织约100 mg，迅速把组织放入预冷好的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至组织被研磨成粉末状，采用RNA的Trizol提取法提取总RNA，1％的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，核酸蛋白检测仪检测RNA提取的浓度与纯度，提取的RNA置于－80 ℃保存备用。
1．4 RT－PCR扩增
反转录反应按PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒（TaKaRa公司）进行， 反转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s终止反应。以合成的第一条cDNA链为模板，以IGFBP－7基因的特异性引物进行PCR扩增，扩增体系为50 μL，扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，62 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。
1．5 RT－PCR产物克隆
将回收的RT－PCR产物与PMD 18－T载体连接，载体与片段的摩尔比控制在1∶2～10，根据凝胶电泳或核酸蛋白仪检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。轻轻涡旋离心管以混合内容物，短暂离心，将混合反应液置于16 ℃水浴中过夜连接。用灭菌牙签挑取单个白色菌落，接种于含有Amp的1．5 mL LB培养液中，37 ℃，200 r/min振荡培养过夜。次日吸取1 μL菌液作模板，依据RT－PCR扩增体系和条件进行PCR鉴定，通过1％琼脂糖凝胶电泳来检测目的条带。据菌液PCR检测结果，吸取含有目的条带的1 mL菌液，送往Invitrogen公司测序。
1．6 生物信息学分析
将测序结果与测序峰图结合进行校对，寻找基因的起始密码子与终止密码子，确定基因的编码区序列。用NCBI的Blast服务器和Clustal W软件进行序列的同源性分析。核酸序列与其他物种比对后，利用Expasy服务器（http：//au．expasy．org/tools/）相关软件预测各个基因的氨基酸序列的分子质量、等电点和氨基酸组成等，将序列提交到ExPASy ScanProsite、HNN、SWISS－MODEL服务器，预测蛋白质的磷酸化位点、N－磷酸化位点、O－磷酸化位点、跨膜区、信号肽、疏水性、二级结构和功能域等。
2 结果与分析
2．1 总RNA提取及RT－PCR扩增
从凉山半细毛羊的肝脏中提取到的总RNA，经1％琼脂糖疑胶电泳后可以清晰地观察到3条带。由图1可见。以迁移率从大到小依次是5 S rRNA、18 S rRNA、28 S rRNA，28 S rRNA条带亮度大约为18 S rRNA条带的两倍，5 S rRNA条带亮度较低，总RNA样品完整、降解较少、质量良好。以凉山半细毛羊的肝脏组织的cDNA为模板，用IGFBP－7基因的引物扩增，得到的长度约850 bp，凝胶电泳检测结果见图2。
2．2 序列分析
根据正反测序进行校正，采用DNAMAN去除载体序列和寻找上下游引物序列，确定各个基因编码氨基酸的CDS序列，IGFBP－7基因的完整CDS序列长度为846 bp，编码282个氨基酸。利用NCBI中的Blast程序比对克隆的凉山半细毛羊IGFBP－7基因与近源物种的同源性，结果表明，凉山半细毛羊IGFBP－7基因与牛、人、鼠的CDS区的同源性分别为99％、95％、90％，氨基酸序列同源性分别为98％、93％、89％；同源性比对结果显示克隆的序列为绵羊IGFBP－7基因的CDS序列，将PCR扩增得到的序列提交到NCBI，登录号为FJ589640．1。
利用BioEdit软件对此次试验克隆得到的凉山半细毛羊IGFBP－7基因的CDS编码区的碱基组成成分进行分析（图3），其A、C、G和T等4种碱基组成含量分别为18．49％、31．45％、33．69％和16．37％，单链分子质量为259．0 ku，双链分子质量为518.0 ku；氨基酸分子质量为29．0 ku， 理论等电点（pI）为8．25。
2．3 IGFBP－7基因的分子进化
从NCBI的GenBank数据库下载牛、鼠、人、鸡、斑马鱼和鲍等物种的IGFBP－7基因的氨基酸序列，用Mega 6．06软件的Neighbor－Joining程序构建凉山半细毛羊IGFBP－7基因的分子系统发育树（图4），可见其IGFBP－7基因与其他物种的进化关系跟传统的分类比较一致，绵羊与牛关系最近，最先聚合，随着亲缘关系的远近逐步与猪、人、鼠、鸡、斑马鱼和鲍聚合。
2．4 蛋白质特性预测
2．4．1 疏水性分析 蛋白质的疏水性分析采用ExPASy在线平台的ProtScale程序计算绵羊IGFBP－7基因的疏水性图谱。结果（图5）表明，IGFBP－7基因的N段区域与C段区域，疏水性区域与亲水性区域间隔较为均匀分布，因此，预测IGFBP－7基因与IGF－Ⅰ和IGF－Ⅱ基因的结合相对较弱。
2．4．2 信号肽分析 根据蛋白质的疏水性分析，IGFBP－7基因的蛋白质可能存在信号肽，将IGFBP－7基因的氨基酸序列提交到SignalP 3．0服务器（http：//www．cbs．dtu．dk/services/SignalP/），结果（图6）表明，IGFBP－7基因的蛋白质的N段存在信号肽的概率为0．999，信号肽的长度为26个氨基酸残基，切割位置为Ser－Ser之间。
2．4．3 跨膜区分析 联网到“http：//www．ch．embnet．org/software/TMPRED－form．html”进行蛋白质的跨膜区预测。结果（图7）表明，IGFBP－7基因存在3个跨膜区，剔除信号肽位置处的跨膜区，该基因存在两个跨膜区，分别为98-114和169-192两个位置处。
2．4．4 磷酸化和糖基化位点 利用NetPhos 2．0在线磷酸化位点预测服务器，对克隆的IGFBP－7基因的磷酸化位点预测（http：//www．cbs．dtu．dk/services/）。结果（图8）表明，IGFBP－7基因中共发现16个磷酸化位点，分别为Ser（12）、Thr（2）、Tyr（2）。
利用NetNGlyc1．0及NetOGlyc3．1服务器，对克隆的IGFBP－7基因的分子进行N－糖基化和O－糖基化位点预测（http：//www．cbs．dtu．dk/services/）。结果（图8）表明，IGFBP－7共有4个N－糖基化位点，分别位于171、194、215、252位置；有1个O－糖基化位点，位于155位置。
2．5 二级结构分析
利用HNN在线二级结构预测服务器，对IGFBP－7蛋白预测（http：//npsa－pbil．ibcp．fr/cgi－bin/npsa＿automat．pl？page＝npsa＿nn．html）。结果（图9）表明，IGFBP－7以无规卷曲为主，其次为α－螺旋，β－折叠最少。IGFBP－7的无规卷曲、α－螺旋、β－折叠区域分别占64．89％、19．86％、15．25％。
2．6 蛋白质功能域预测及分析
将序列提交到ExPASy ScanProsite（http：//www．expasy．org/tools/scanprosite/）结构域分析数据库，进行蛋白质结构域的查找与分析。结果（图10）表明，克隆的IGFBP－7基因的N端具有一个IGFBP＿N功能域序列，位于28－114；在C端，IGFBP－7具有一个Ig－like（160－264）域，含有一个二硫键（181－248）。
3 小结与讨论
蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等，在所克隆的6个基因中，以在线预测存在大量的磷酸化和糖基化等修饰过程。磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白质的特定位点上的过程，大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白质磷酸化所调控的，至少有30％的蛋白质被磷酸化修饰［7，8］。磷酸化的作用位点为蛋白质上的Ser、Thr和Tyr残基，在磷酸化调节过程中，细胞的形态和功能都发生改变，可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导、肿瘤发生、新陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等。在细胞信号转导过程中，作为细胞信号的一些激素或细胞因子与细胞膜受体或细胞内受体结合并被激酶激活，激素或信号因子随着激酶的磷酸化也被磷酸化，引起细胞内的信号效应。IGFBP－7蛋白共发现16个磷酸化位点、4个N－糖基化位点和1个O－糖基化位点。
IGFBP－7在保守的N－端区域存在12个Cys，形成6个二硫键，其二硫键是以相邻的2个Cys依次而构成，形成IGFBP－7的第一亚域，在C－端的保守区域内存在2个Cys，形成1个二硫键，构成第二亚域，在绵羊的IGFBP－7蛋白氨基酸序列的二硫键跟人的研究一致［9，10］，经二硫键折叠形成稳定、精细的IGFBP－7的球状结构，保证了高级结构与IGFs结合的亲和力。IGFBP－7的ACGCCXXC取代了GCGCCXXC序列［11］，取代了IGFBP－1、IGFBP－2、IGFBP－3、IGFBP－4和IGFBP－5等的GCGCCXXC序列，可能导致了IGFBPs与IGFs结合的差异。IGFBP－7在N－端都具有一个完整IGFBP＿N功能域序列和一个Ig－like域。正因IGFBP－7具有的Ig－like域而表现出与IGFs较低的亲和力，反而与胰岛素具有较高的亲和力。
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