郭 健1，韩丝银2a，李小冰2b，宋文东1
（1．浙江海洋学院，浙江 舟山 316022；2．广东海洋大学， a.食品科技学院；
b． 理学院，广东 湛江 524088）
摘要：以制备鲎试剂产生的废料血浆为原料，经盐酸水解后，水解液进行美拉德反应，通过固相微萃取－气相色谱－质谱法（SPME－GC－MS）测定反应产物中的挥发性成分，分析了其呈香机理。结果表明，鲎血水解液在pH为8.0，100 ℃加热2 h，其美拉德反应的褐变程度最强，确定了39种挥发性成分，主要包括烃类5．13％、酮类1．47％、酸类2．64％、醛类14．08％、酯类1．24％、酚类0．84％、醇类4．33％及含氮化合物0．26％。该结果可为开发苯甲醛、食品香精及卷烟改良剂等方面提供参考。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：鲎血；水解液；美拉德反应；挥发性成分
中图分类号：TS202 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1471-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.049
Analyzing Volatile Components in Maillard Reaction Products of
Limulus Blood Hydrolysate
GUO Jian1，HAN Si－yin2a，LI Xiao－bing2b，SONG Wen－dong1
（1． Zhejiang Ocean University， Zhoushan 316022， Zhejiang， China； 2a． College of Food Science and Technology
2b． College of Science， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， Guangdong， China）
Abstract： The waste blood of horseshoe crab， as the by－product of limulus reagent， was hydrolyzed by hydrochloric acid. The volatile components in Maillard reaction products of hydrolysate were detected with SPME－GC－MS. Its aroma mechanisms was studied． The results showed that the highest browning degree reached at pH 8 after incubating hydrolysate under 100 ℃ for 2 h． 39 compositions including 5．13％ hydrocarbons，1．47％ ketones，2．64％ acids，14．08％ aldehydes，1．24％ esters，0．84％ phenols，4．33％ alcohols and 0．26％ nitrogenous compound were identified in this hydrolysate． It will provide a reference for developing benzaldehyde， food flavor and cigarette ameliorant．
Key words： horseshoe crab′s blood； hydrolysate； Maillard reaction； volatile component
收稿日期：2014－07－10
基金项目：广东省自然科学基金项目（S2012020011054）
作者简介：郭 健（1979－），女，黑龙江牡丹江人，讲师，在读博士研究生，研究方向为天然药物，（电话）18305808598（电子信箱）
18305808598@163．com；通信作者，宋文东，教授，主要从事天然药物开发研究，（电话）0759－2396163（电子信箱）songwd60@163．com。
鲎（Limulus）亦称马蹄蟹，属肢口纲剑尾目海生节肢动物，分为美洲鲎、东方鲎、巨鲎和圆尾鲎，常见于亚洲和北美东海岸，中国主要分布于广东、广西、福建沿海海域［1］。目前其血液广泛用于细菌内毒素和真菌葡聚糖检测，同时也导致大量鲎血废料浪费，为提高该海洋资源的综合利用率，近年已有开展鲎血液中的微量元素及活性蛋白的集中研究［2－5］，但美拉德反应尚未见报道。
美拉德反应（Maillard reaction）属非酶促褐变反应，是氨基化合物（氨基酸、肽及蛋白质）与羰基化合物（糖类）发生的复杂反应，是加工食品色泽和各种风味的主要来源，也是目前食品化学、食品工艺学、营养学、香料化学等领域的研究热点［6］，本试验采用SPME－GC－MS法测定了鲎试剂生产废血水解液美拉德反应产物中的挥发性成分，并分析研究了其呈香机理，初步探讨了其应用领域，为开发利用鲎试剂的废血提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
鲎血，由湛江博康海洋生物有限公司提供；所用试剂均为分析纯。
1．2 主要仪器
QP-2010型气相色谱－质谱联用仪（日本岛津公司）；DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；真空抽滤装置（北京京辉凯业科技有限公司）。
1．3 方法
1．3．1 主要工艺流程 鲎血→盐酸水解→调节pH→美拉德反应→固相微萃取法富集挥发性成分→气相色谱－质谱联用仪（GC/MS）检测。
1．3．2 鲎血水解液的制备 取鲎试剂产生的废料血浆50 mL，用10倍体积3 mol/L的盐酸沸水回流4 h。
1．3．3 褐变程度的测定 美拉德反应产生一类物质称为类黑精，随着美拉德反应时间的延长，颜色也越深，测定OD420 nm，以表示美拉德反应的褐变程度［7，8］。
1．3．4 pH对鲎血水解液美拉德反应的影响 取10 mL的鲎血水解液6份，静置至室温后，用6 mol/L NaOH溶液调节pH分别为5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0，于100 ℃水浴加热2 h，抽滤后，按“1．3．3”测定褐变程度。
1．3．5 温度对鲎血水解液美拉德反应的影响 取10 mL的鲎血水解液6份，静置至室温后，用6 mol/L NaOH溶液滴定至pH为8．0，于50、60、70、80、90、100 ℃水浴加热2 h，抽滤后，按“1．3．3”测定褐变程度。
1．3．6 时间对鲎血水解液美拉德反应的影响 取10 mL的鲎血水解液6份，静置至室温后，用6 mol/L NaOH滴定至pH为8．0，在100℃条件下，分别水浴0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0 h，抽滤后，按“1．3．3”测定褐变程度。
1．3．7 产物的香气评价［9］ 反应产物放置1 d后，将闻香纸浸入样品1～2 cm，在离闻香纸2～3 cm处，吸闻3次，每次2～3 s，并用文字描述香气特征。
1．3．8 美拉德反应产物挥发性成分分析 取样品5 mL于20 mL 顶空密封样品瓶中，55 ℃水溶，以固相微萃取纤维PDMS（使用前于250 ℃老化2 h）萃取40 min，200 ℃下3 min进样。GC/MS条件：柱温0～4 min为40℃，4～44 min以5 ℃/min升温至240 ℃，44～49 min保持240 ℃，进样口温度250 ℃，不分流，He流速1 mL/min；离子源电压70 eV。
2 结果与分析
2．1 pH对鲎血水解液美拉德反应的影响
pH对鲎血水解液美拉德反应的影响见图1。由图1可知，当pH＜8．0时，随着pH增大，褐变程度增强，在pH 8．0时吸光度最大，当pH＞8．0时，随pH值升高，褐变程度减弱，故最佳pH确定为8．0。
2．2 温度对鲎血水解液美拉德反应的影响
温度对鲎血水解液美拉德反应的影响见图2。由图2可知，在一定温度范围内，褐变程度随着温度升高而增强，考虑实际操作，确定最佳反应温度为100 ℃。
2．3 时间对鲎血水解液美拉德反应的影响
时间对鲎血水解液美拉德反应的影响见图3。由图3可知，随时间延长，美拉德反应的褐变程度先增大后稳定，2 h后，褐变程度变化不大，故选择最佳反应时间为2 h。
2．4 反应产物分析
感官评价发现鲎血水解液的苦杏仁香味醇厚浓郁，果香味淡薄，但香味持久，愉悦感较强。鲎血水解液美拉德反应体系经GC－MS鉴定出的挥发性成分见表1。
用固相微萃取法富集鲎血水解液美拉德反应产物中的挥发性成分，经GC－MS鉴定出39种化合物，包括烃、酮、酸、醛、酯、酚、醇及含氮化合物等8大类。其中，烃类12种、酮类6种、酸类7种、醛类4种、酯类3种、酚类2种、醇类3种及含氮化合物2种，含量分别为5．13％、1．47％、2．64％、14．08％、1．24％、0．84％、4．33％、0．26％。
在上述成分中，醛类含量最高，其中苯甲醛占13．22％，是鲎血水解液美拉德反应产物的特征香气成分，具苦杏仁味。该化合物在自然界中以苷形态存在，是天然苦杏仁油的主要成分，存在于核桃油、橙花油、广藿香油、肉桂油等精油里面，是世界第二大香料，广泛用于食品、饮料、烟草以及化妆品等行业，该化合物也是许多药物的起始原料［10－12］。据预测，中国苯甲醛的需求量将以每年约7％速率递增，因此，通过鲎血水解液的美拉德反应获得苯甲醛可满足相关产业需求［13］。此外，还有其他微量的醛类，其中丙酮醛具焦糖样甜味，作为香料，可用于食品及食品添加剂［14］。壬醛是一种天然香料，其本身具有玫瑰香气，还极微量用于食用香精［15］。这些产物大部分是通过Strecker降解，α－氨基酸与α－二羰基化合物反应，失去CO2降解为少一个碳的醛类，各种不同特殊醛类（亦称Strecker醛类）是造成产物醇厚而不刺激的苦杏仁味的主要原因。烃类化合物具有较高的芳香阈值，一般不具有风味活性。酸类和酚类都可作为抗菌剂，增强了反应产物的安全性。酮类、酯类主要由多不饱和脂肪酸的热氧化或降解、氨基酸降解产生，对香味的形成起到了修饰的作用［16］，酮类物质中的苯乙酮具有山楂水果清香，其产物香气更具渗透性，可以起到矫正杂质气味作用，此反应产物中少量的含氮类本是有一定刺激味，但因此而掩盖。醇类物质中的柏木脑具有愉快而持久的柏木香味，增加了反应产物诱人的嗅香。
根据鲎血水解液美拉德反应产生的挥发性成分及呈香分析表明，鲎血水解液美拉德反应产物具有潜在的应用前景，如开发苦杏仁香味的食品香精。另外，由于用美拉德产物包埋可提高保留率，在卷烟燃吸时释放降低烟气毒害［17，18］，因此该产物对卷烟具有减害增香效果，可开发为卷烟改良剂。
3 结论
采用固相微萃取－气相色谱－质谱法检测出水解液美拉德反应产物的挥发性成分包括：烃类、酮类、酸类、醛类、酯类、酚类、醇类及含氮类等，形成了鲎血水解液美拉德反应后醇厚浓郁的苦杏仁香味，该结果可为挖掘鲎血在苯甲醛、食品香精及卷烟改良剂等方面的开发提供参考。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［1］ 李兆英，万维涛．鲎素的研究及开发利用［J］．陕西农业科学， 2011，16（5）：189－191．
［2］ 刘慧明，丁 航，汪亚君，等．鲎血中微量元素含量分析［J］．广东微量元素科学，2007，14（8）：37－39．
［3］ 谢海伟，代建国，郭 勇．海洋远古生物鲎体内活性物质的研究［J］．安徽农业科学，2006，34（24）：6512－6515．
［4］ 张海涛，祝其锋．鲎血细胞多肽对不同肿瘤细胞生长的影响［J］． 中国现代应用医药杂志，2001，18（3）：208－209．
［5］ 李 俊，韦世秀．鲎血中超氧化歧化酶的提取及部分性质的研究［J］．时珍国医国药，2011，22（4）：842－844．
［6］ JENNIFER AM． Application of the Maillard reaction in the food industry［J］． Food Chemistry， 1998， 62（4）： 431－439．
［7］ CALLIGARIS S， MANZOCCO L， ANESE M， et al． Effect of heat treatment on the antioxidant and pro－oxidant activity of milk［J］． International Dairy Journal， 2004， 14（5）： 421－427．
［8］ 张凌燕，李 倩，尹 姿，等． 3种氨基酸和葡萄糖美拉德产物的物理化学特性［J］．中国食品学报，2008，8（3）：12－22．
［9］ 孙寒潮，刘通讯．脂肪对美拉德反应产物挥发性香气成分的影响研究［J］．食品工业科技，2007，28（9）：87－90．
［10］ 李幸苗．拉米夫定的药理与临床［J］．中国药师，2004，6（2）：111－113．
［11］ KOSZALKAGW， BURNSC L． Enzyme－mediated enantioselective preparation of pure enantiomers of the antiviral agent 2c， 3c－dideoxy－5－fluoro－3c－thiacytidine （FTC） and related compounds［J］． Journal of Organic Chemistry，1992，57（21）： 5563－5565．
［12］ STORER R， CLEMENS I， LAMONT B， et al． The resolution and absolute stereochemistry of the enantiomers of cis－ 1－［2－（hydroxymethyl）－1， 3－oxathio－lan－5－yl］cytosine（BCH189）： Equipotent anti－HIV agents［J］． Nucleosides Nucleotides， 1993， 12（2）：225－236．
［13］ 张 昕，吴伟伟，黄启权，等．苯甲醇液相氧化制苯甲醛催化剂的研究进展［J］．石油化工，2010，39（2）：215－223．
［14］ 张精安，陈育平．丙酮醛的合成研究［J］．精细化工，2000，17（9）：507－510．
［15］ 刘苗苗，谢晓芸．芥酸甲酯氧化裂解制得壬醛的探究［J］．化工时刊，2012，26（4）：19－22．
［16］ 彭 芳．黄酮类化合物的生物学作用［J］．大理医学院学报， 1998，7（4）：52－54．
［17］ 杜佳喆．玉米蛋白水解产物美拉德反应制香精的研究［D］． 济南：山东轻工业学院，2006．
［18］ 谷风林．酪蛋白美拉德产物的制备、性质、及在烟草中的应用研究［D］．江苏无锡：江南大学，2010．