朱静平
（西昌学院轻化工程学院，四川 西昌 615013）
摘要：以油橄榄（Olea europaea L．）叶片为原料，以芦丁为对照品，先通过单因素试验、再采用正交试验优选总黄酮提取工艺，确定分光光度法作为测定方法，其选用AlCl3作为显色剂，在波长415 nm、显色时间15 min条件下，对5个油橄榄品种叶片中的总黄酮提取量进行测定比较。结果表明，最佳提取工艺为提取溶剂90%（体积分数）乙醇、提取温度60 ℃、料液比1∶19、回流时间1．5 h。不同品种油橄榄叶片中总黄酮的提取量并不相同，在皮瓜尔（O． europaea cv． Picual）、科拉蒂（O． europaea cv． Coratina）、莱星（O． europaea cv． Leecio）、佛奥（O． europaea cv． Frantoio）、配多灵（O． europaea cv． Pendollin）5个品种中，以科拉蒂的叶片总黄酮提取量最高，莱星的含量最低。通过比较不同品种油橄榄叶片中总黄酮提取量的高低，为油橄榄叶片总黄酮的生产和应用提供了试验基础支撑，也将为当地的油橄榄综合开发提供技术保障。
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关键词 ：油橄榄（Olea europaea L．）；叶片；总黄酮；提取工艺；提取量
中图分类号：S565．7；Q944．56；O629 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）06－1412－04
DOI：10．14088/j．cnki．issn0439－8114．2015．06．033
Comparing Technologies of Extracting Total Flavonoids from Leaves
of Different Olea europaea Varieties
ZHU Jing－ping
（School of Applied and Chemical Engineering， Xichang College， Xichang 615013， Sichuan， China）
Abstract： The technology of extracting total flavonoids from Olea europaea L． leaves was optimized with single－factor experiment and orthogonal experiment using rutin as control． The contents of total flavonoids in leaves of five O． europaea varieties were compared with spectrophotometry using AlCl3 as chromogenic agent under the wavelength of 415 nm and chromogenic time of 15 min． The results showed that the optimal conditions were 90％ ethanol， 60 ℃， material to solvent ratio of 1∶19， refluxing extraction time of 1．5 h． Contents of total flavonoids were different in leaves of different olive varieties． Among O． europaea cv． Picual， O． europaea cv． Coratina， O． europaea cv． Leecio， O． europaea cv． Frantoio， O． europaea cv． Pendollin， the content of total flavonoids in O． europaea cv． Coratina was the highest， while the lowest in O． europaea cv． Leecio． It will provide experimental basis for producing and utlizing flavonoids in leaves of O． europae， and technical support for comprehensively developing the local olive．
Key words： Olea europaea L．； leaf； the total flavonoids； extraction process； content
收稿日期：2014－05－16
基金项目：四川省教育厅科研项目（12ZB123）
作者简介：朱静平（1981－），女，四川西昌人，副教授，硕士，主要从事化学、环境化学方面的研究，（电话）13795629000（电子信箱）zjp816@126．com。
油橄榄（Olea europaea L．）又名洋橄榄、齐敦果，为木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea L．）常绿阔叶乔木，其栽培种具有较高的食用价值，可提炼优质食用植物油——橄榄油［1］。自20世纪60年代起，油橄榄开始在中国引种，其中甘肃省陇南市武都区是目前全国最大的油橄榄种植基地，现保存并培育有多个品种，如佛奥（O． europaea cv． Frantoio）、莱星（O． europaea cv． Leecio）、配多灵（O． europaea cv． Pendollin）、科拉蒂（O． europaea cv． Coratina）、皮肖利（O． europaea cv． Picholine）、戈达尔（O． europaea cv． Gordal）、九峰6号（O． europaea cv． Jiufeng No．6）、皮瓜尔（O． europaea cv． Picual）、阿斯（O． europaea cv． Ascolano）、格罗莎（O． europaea cv． Grossa）、鄂植8号（O． europaea cv． E－zhi No．8）、中山24号（O． europaea cv． Zhongshan 24）、城固32号（O． europaea cv． Chenggu 32）等。在四川省境内，从油橄榄的生存生态条件要求气候指标如气温、降水、空气湿度、日照等方面来分析，西昌地区是比较适宜油橄榄发展的区域。当地已有近40年油橄榄引种栽培的历史，在油橄榄品种引进、筛选方面做了大量的工作，初步具备了采用优良品种进行生产栽培的基础条件［2］。但是油橄榄的果渣、榨油废水和叶片等废弃物的利用还是空白，综合利用还有待开发。据报道，油橄榄叶片中的活性成分主要是有机酸、蛋白质、氨基酸、黄酮类物质等［3］；然而油橄榄品种繁多，虽然不同的品种其叶片中所含的活性成分大致相同［4］，但活性成分的含量是否一致还未见报道。因此有必要对不同品种油橄榄叶片进行活性成分的含量检测，以期为油橄榄叶片的合理利用提供理论基础。鉴于此，试验采用单因素、正交试验方法，优选出最佳提取油橄榄叶片中总黄酮的工艺；然后在最佳提取工艺条件下，对5个油橄榄品种叶片中的总黄酮进行了测定分析与比较，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 材料
试剂有无水三氯化铝（AR）、95％（体积分数，下同）乙醇，以芦丁为对照品，都为国药集团化学试剂有限公司出品。
参试仪器主要有722S可见光分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、98－1－BWAY－2S电子调温电热套（天津市泰斯特有限公司）、SHZ－Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）、HH－4数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）、ZN－400A微型高速粉碎机（长沙市中南制药厂）、ETTLERAE 240电子天平（瑞士METTLER公司）。
植物材料有油橄榄叶片，由凉山州国家油橄榄良种基地提供，品种为皮瓜尔、科拉蒂、莱星、佛奥、配多灵。将采摘的各品种油橄榄叶片置于实验室内自然阴干，干燥后的油橄榄叶片于微型高速粉碎机中粉碎，然后放在干燥器皿中备用。
1．2 总黄酮的测定
1．2．1 标准曲线的绘制 用芦丁对照品制备芦丁标准溶液，从芦丁标准溶液（0．079 2 mg/mL）中分别精确移取 0．0、2．5、5．0、7．5、10．0、12．5 mL置于25 mL容量瓶中，都加30％乙醇至12．5 mL，摇匀，再分别加入10 mL 1％的AlCl3溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，放置15 min后，在415 nm下测定溶液的吸光度值；以浓度－吸光度进行回归，绘制标准曲线，求得回归方程。
1．2．2 总黄酮测定 对5个品种油橄榄叶片按最佳提取工艺条件提取总黄酮后，分别取各样品溶液2．5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入30％乙醇至12．5 mL，摇匀，再分别加入10 mL 1 ％的AlCl3溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀后放置15 min，于415 nm下测定吸光度值［5］，计算总黄酮的提取量。
1．3 单因素试验
1．3．1 乙醇浓度对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响
称取10 g油橄榄叶片样品置于250 mL圆底烧瓶中，分别用60％、70％、80％、90％、95％的乙醇为溶剂，在提取温度为80 ℃、料液比为1∶13的条件下，水浴加热回流2 h，真空抽滤2次，常压蒸馏回收乙醇，浓缩液用去离子水定容至250 mL，静置沉降24 h后，取上清液10 mL，用60％乙醇定容至100 mL，即样品溶液。取样品溶液2．5 mL按“1．2．2”的方法测定样品溶液的吸光度值，并计算总黄酮的提取量。
1．3．2 提取温度对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响
称取10 g油橄榄叶片样品，用90％乙醇溶解，料液比1∶13，分别在40、50、60、70、80 ℃的条件下水浴加热回流2 h，按“1．3．1”的方法测定样品溶液的吸光度值，并计算总黄酮的提取量。
1．3．3 料液比对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响
称取10 g油橄榄叶片样品，用90％乙醇溶解，分别在料液比为1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21的条件下进行总黄酮提取，温度都控制在70 ℃，水浴加热回流2 h，按“1．3．1”的方法测定样品溶液的吸光度值，并计算总黄酮的提取量。
1．3．4 回流时间对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响
称取10 g油橄榄叶片样品，在90％乙醇、料液比1∶19、提取温度70 ℃条件下，分别回流1．0、1．5、2．0、2．5、3．0 h，再按“1．3．1”的方法测定样品溶液的吸光度值，并计算总黄酮的提取量。
1．4 正交试验
在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、提取温度、料液比、回流时间作为考察因素，以测定的油橄榄叶片中总黄酮的提取量为考察指标，采用L9（34）正交试验方法对样品中的总黄酮进行提取，以总黄酮提取量为指标进行试验优化，来确定最佳的提取工艺条件。L9（34）正交试验各因素、水平设置见表1。
2 结果与分析
2．1 单因素试验结果
2．1．1 标准曲线 试验绘制的标准曲线见图1。以浓度－吸光度进行回归所得到的线性回归方程为y＝29．904x＋0．013 8，相关系数R2＝0．999 6。
2．1．2 乙醇浓度对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响 乙醇浓度对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响结果见图2。从图2可以看出，乙醇浓度较低时，总黄酮提取量也较低，说明对原料的提取不够完全；而乙醇浓度太大时可能使一些脂溶性的杂质溶解增加，从而影响了黄酮类化合物的溶出。所以乙醇浓度为90％（体积分数）时，油橄榄叶片中总黄酮的提取量最大。因此选择90％的乙醇为提取溶剂。
2．1．3 提取温度对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响
提取温度对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响结果见图3。从图3可见，油橄榄叶片总黄酮的提取量随提取温度的升高而逐渐增加，在提取温度为70 ℃时提取量最高，70 ℃以后又逐渐降低。分析显示，在40～70 ℃的范围内随着温度升高，分子运动加快，溶质分子与溶剂分子能够充分接触，可使黄酮类化合物更容易地溶解到溶剂中；而超过70 ℃后随着热效应的影响，杂质的溶出量开始增加，一些活性成分也会被破坏，所以综合考虑提取温度宜在70 ℃左右。
2．1．4 料液比对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响
料液比对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响结果见图4。从图4可以看出，随着料液比的减少总黄酮的提取量逐渐增高，在1∶17时提取量最高，而在1∶19～1∶21提取量呈现降低趋势。当料液比达到一定比例时，黄酮类成分已基本溶出，再减少料液比，可能由于总黄酮被反应消耗了，反而降低了总黄酮的提取效果。同时随着溶剂量的增加，回收试剂的能耗就越高，不利于提高经济效应。因此选择料液比为1∶17。
2．1．5 回流时间对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响
回流时间对油橄榄叶片总黄酮提取量的影响结果见图5。由图5可以看出，随着回流时间的延长，黄酮类化合物的提取量先上升后下降。在 1～2 h内上升趋势明显，2 h达到最大值，2 h之后有下降趋势。说明刚开始时由于时间较短、黄酮类物质与溶剂还没充分反应溶出，所以在2 h时刚好达到溶出平衡，使提取量最高；而时间超过2 h后，溶剂的挥发导致乙醇浓度降低或者杂质溶解增加，进而影响了黄酮类化合物的溶出，使黄酮类化合物的提取量有所下降。因此选择回流时间为2 h。
2．2 正交试验结果
L9（34）正交试验提取油橄榄叶片总黄酮的比较结果见表2。从表2分析可知，乙醇浓度、提取温度、料液比和回流时间这4个因素对油橄榄叶片总黄酮提取量影响的主次顺序为乙醇浓度、料液比、提取温度、回流时间，根据正交试验得出的最佳提取条件为乙醇浓度90％、提取温度60 ℃、料液比1∶19、回流时间1．5 h。
2．3 不同品种油橄榄叶片中的总黄酮提取量测定
在乙醇浓度90％、提取温度60 ℃、料液比1∶19、回流时间1．5 h的最佳提取条件下。测定皮瓜尔、科拉蒂、莱星、佛奥、配多灵5个油橄榄品种叶片的总黄酮含量，结果见表3。从表3可见，以科拉蒂的叶片总黄酮含量最高，莱星的含量最低。
2．4 加标回收试验
称取10 g油橄榄各品种叶片样品粉末，用90％乙醇为溶剂，然后在提取温度60 ℃，料液比1∶19的条件下，水浴加热回流1．5 h，真空抽滤2次，常压蒸馏回收乙醇，浓缩液用去离子水定容至250 mL，静置沉降24 h，各取上清液10 mL，用60％乙醇定容至100 mL。每个品种分别精密量取上述溶液2．5 mL，置于5个25 mL容量瓶中，加30％乙醇至12．5 mL，摇匀，再分别加入10 mL 1 ％的AlCl3溶液，其中3份各加入1 mL芦丁标准液，用30％乙醇定容，摇匀放置15 min后，于415 nm处测定吸光度值，取均值，计算出加标回收率，结果见表4。从表4可见，5个油橄榄品种叶片的加标回收率在96．09％～101．01％，表明这个结果较为可信，所得到的叶片总黄酮含量也可观，具有提取的价值。
3 小结
试验得出的油橄榄叶片中总黄酮最佳提取工艺为乙醇浓度90％（体积分数）、提取温度60 ℃、料液比1∶19、回流时间1．5 h。用此工艺对皮瓜尔、科拉蒂、莱星、佛奥、配多灵5个油橄榄品种叶片中的总黄酮进行提取，其分光光度法的显色剂为AlCl3，最大吸收波长在415 nm处，最佳显色时间为15 min。结果表明，不同油橄榄品种叶片的总黄酮提取量并不相同，但差别不是很大，其中科拉蒂的叶片总黄酮提取量最高，其次分别为配多灵、佛奥、皮瓜尔、莱星，莱星的提取量最低；加标回收率在96．09％～101．01％，表明这个结果较为可信，方法也简单易操作，能为西昌地区油橄榄叶片中总黄酮的提取及应用提供一定的试验基础支撑，也将为当地的油橄榄综合开发提供技术保障。
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参考文献：
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