胡 洲，徐 彬，张 发，廖光辉，杨晓燕
（大理学院农学与生物科学学院，云南 大理 ６７１００３）
摘要：比较分离自温泉、淡水及土壤的捕食线虫真菌——少孢节丛孢（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）的生长特性及捕食效力。通过测定三种生境少孢节丛孢在不同温度、ｐＨ及有氧和无氧条件下的生长率及其在最适培养条件下对线虫的捕食率，得出三种生境中少孢节丛孢的最适生长温度均为３０ ℃，分离自温泉和土壤的少孢节丛孢最适ｐＨ分别为５．５～７．０和４．５～５．５，而淡水生境少孢节丛孢对不同ｐＨ具有广泛适应性；淡水和温泉生境少孢节丛孢对无氧环境有一定的耐受性，而土壤生境少孢节丛孢在无氧环境下生长率低至１．２４ ｃｍ／５ ｄ。三种生境的少孢节丛孢捕食效力没有显著性差异。
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关键词 ：生境；少孢节丛孢（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）；生长特性；捕食效力
中图分类号：Ｓ４７６．１５ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1609-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.020
线虫病是动植物的一大类寄生虫病，每年给农牧业造成巨大的损失［１，２］。长期使用化学药物对寄生虫病进行防治，易使虫体产生抗药性，且化学药物的某些有害成分排出机体后，会对环境造成污染，进而影响自然界的生态平衡；药物残留成分随着畜产品和农产品——奶、蛋、肉、蔬菜、水果等进入人体，最终对人体健康造成危害。因而用捕食线虫真菌对寄生线虫进行生物防治，可以避免上述问题的产生，无论从经济效益还是从社会效益来看，其发展和应用的前景都是巨大的［３］。国内外在农作物线虫的生物防治上已有了商品化的食线虫真菌制剂。从自然环境中筛选捕食线虫真菌并对其生长特性及捕食效力测定是捕食线虫真菌作为生防菌株筛选的重要环节之一，而不同生境捕食线虫真菌的生长特性及捕食效力是否存在差异，目前还没有相关报道。少孢节丛孢是目前研究最为全面的捕食线虫真菌之一［４－１０］。近年来，本实验室先后从大理周边环境分离得到不同生境的少孢节丛孢菌株，旨在比较来自温泉、淡水和土壤的少孢节丛孢菌株在不同温度、ｐＨ、有氧和无氧条件的生长特性及其捕食效力的差异，探讨不同生境对捕食线虫真菌适应能力的影响，研究结果可为今后生防捕食线虫真菌的筛选和应用提供理论依据和数据支持。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 供试菌种 三种生境少孢节丛孢（Arthrobotrys ｏｌｉｇｏｓｐｏｒａ）菌株由大理学院农学与生物科学学院微生物实验室提供。
１．１．２ 培养基的配制 ０．４ ｇ／Ｌ 玉米粉琼脂培养基（ＣＭＡ）：称取４０ ｇ新鲜玉米粉，加入１ ０００ ｍＬ去离子水，微火煮沸１ ｈ，补足水分至１ ０００ ｍＬ，用纱布过滤后，取滤液１０ ｍＬ，加９９０ ｍＬ去离子水，再加入２０ ｇ琼脂粉，经１２１ ℃ ３０ ｍｉｎ高压灭菌后，倾注于直径为６０ ｍｍ的灭菌玻璃培养皿中备用。不同ｐＨ培养基配制方法同上，然后用１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ和ＨＣｌ分别调整ｐＨ至４．５～８．５，经１２１ ℃ ３０ ｍｉｎ高压灭菌后，倾注于直径为６０ ｍｍ的灭菌玻璃培养皿中备用。
１．１．３ 线虫幼虫混悬液 全齿复活线虫（Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ）由农学与生物科学学院微生物实验室提供，制备成线虫幼虫混悬液（约５ ０００条/ｍＬ）备用。
１．２ 生长率比较
１．２．１ 不同温度下生长率的比较 取２０ ℃ ０．４ ｇ／Ｌ ＣＭＡ中培养７ ｄ的３株少孢节丛孢，在培养基边缘切取５ ｍｍ×５ ｍｍ的小块，分别接种于ｐＨ ６．０～６．２的０．４ ｇ／Ｌ ＣＭＡ上，每种菌株分为９组，每组含３个培养基，分别置于５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５ ℃条件下培养，５ ｄ后测算其生长率。
１．２．２ 不同ｐＨ下生长率的比较 取２０ ℃ ０．４ ｇ／Ｌ ＣＭＡ中培养７ ｄ的３种菌株，在培养基边缘切取５ ｍｍ×５ ｍｍ的小块，接入制备好的ＣＭＡ固体培养基中。每种菌株分为９组，分别置于pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的培养基中，每组含３个培养基，做好标记后放入３０ ℃恒温箱内培养７ ｄ。接种次日开始每天定时测量１次菌落直径，直至长满平板。然后测算其生长率。
１．２．３ 有氧和无氧条件下生长率的比较 每种菌株分为２组，每组含３个培养基，所用培养基和接种方法同前。接种菌丝后，分别置于３０ ℃有氧和无氧条件下培养，５ ｄ后分别进行生长率的测定。
１．３ 三种菌株捕食线虫效力比较
试验共设４个组，每组３次重复。第１、２、３组分别接种三种生境少孢节丛孢菌株，第４组为对照组（无菌株）。将各组置于各自最适培养条件下，５ ｄ后，每个平皿内加入幼虫悬液１ ｍＬ（５ ０００ 条／ｍＬ），在体视显微镜下检查其活力，３ ｄ后统计线虫的死亡率。按下列公式计算出菌株捕食线虫的效力，用百分率表示。试验结果采用ｔ检验法进行统计学分析。
Ｒ＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）×１００％。其中，Ｒ为捕食率，Ｘ为被捕获的虫体数，Ｙ为自由活动的虫体数。
１．４ 数据处理
测定各组捕食线虫真菌的菌落直径，以平均值±标准差表示。不同处理试验结果间的差异显著性，采用新复极差法（ＳＳＲ）进行统计分析。
２ 结果与分析
２．１ 生长率比较
２．１．１ 不同温度下生长率比较 由表１可见，三种生境的少孢节丛孢最适生长温度为３０ ℃。统计分析表明此温度条件下，真菌的生长速度与其他温度间差异显著。
２．１．２ 不同ｐＨ下生长率的比较 由表２可见，三种生境捕食线虫真菌生长最适ｐＨ不同。方差分析表明，分离自淡水的捕食线虫真菌在ｐＨ ５．０、５．５时，其生长率差异显著，在ｐＨ ７．０、７．５时，真菌生长较好；分离自土壤的捕食线虫真菌在ｐＨ ４．５～５．５之间，真菌生长较好；分离自温泉的捕食线虫真菌在ｐＨ ５．５～７．０之间，真菌生长较好。
２．１．３ 有氧及无氧环境下生长率比较 由表３可见，淡水和温泉生境的少孢节丛孢在有氧和无氧条件下的生长率差异不显著（Ｐ＞０．０５），而土壤生境少孢节丛孢在无氧条件下的生长率下降明显，生长率差异显著。
２．２ 三种菌株捕食率的比较
三种生境条件下菌株捕食率统计结果（表４）表明，在淡水、温泉和土壤三种生境的少孢节丛孢其捕食效力差异不显著（Ｐ＞０．０５），且三者与对照组相比，捕食效力均达６０％以上。
３ 讨论
不同温度下的生长率比较结果显示，不同生境少孢节丛孢的最适生长温度均为３０ ℃，表明同一地区不同生境条件下的少孢节丛孢对温度的适应性相同。杨晓野等［８］对少孢节丛孢ＣＩＭＨＩ菌株生长温度范围测定为１５～３０ ℃，其中以２０ ℃生长最好。而鄢小宁等［１１］对少孢节丛孢ＨＮＱ１１菌株最适生长温度的测定值为２５ ℃，说明少孢节丛孢存在地区温度适应性的差异。提示在筛选生防捕食线虫真菌的时候，尽量从本地区筛选，缩短菌种的适应周期，以更好更快地发挥其捕食效力。
不同ｐＨ条件下，土壤中的少孢节丛孢在ｐＨ ４．５～５．５之间，即偏酸性的条件下生长比较好；而分离自温泉的少孢节丛孢在不同ｐＨ条件下生长速率波动较大，在ｐＨ ５．５～７．０之间的生长较好；分离自淡水的少孢节丛孢在不同ｐＨ条件下生长速率没有明显差异。从不同菌株的生长环境来看，出现这种情况的原因是由于土壤偏酸性［１２］，长期生长在这种环境中的少孢节丛孢已经适应这种生存环境；温泉中的少孢节丛孢采自于大理弥渡徂莱温泉，温泉水ｐＨ为６．８，实验室测定的最适ｐＨ为６．５，两者差异不大；淡水少孢节丛孢分离自洱海，洱海水质１９８６～１９９６年偏碱性［１３］，随着洱海保护效果的显现，洱海水ｐＨ已经逐渐降低，但仍然会随着季节变动［１４］，导致分离自洱海的淡水捕食线虫真菌具有广泛的酸碱适应能力。
本次试验从温泉和淡水筛选到的少孢节丛孢对无氧环境的耐受力明显好于土壤生境中的少孢节丛孢菌株，出现这种现象的原因可能是由于试验所采集土样为５～１５ ｃｍ土壤，其中氧含量较高所致。试验结果显示，土壤生境中的捕食线虫真菌可能不适合作为动物肠道寄生线虫生防菌株来源（动物肠道为厌氧环境）。结合不同ｐＨ下生长率的比较结果，推测水环境中的捕食线虫真菌对动物肠道环境适应能力更强。而一直以来，土壤被认为是微生物的天然种质资源库，目前已经分离到的捕食线虫真菌也绝大多数来源于土壤，因此有必要加强对水生捕食线虫真菌资源的开发和应用研究。
三种少孢节丛孢在其最适培养条件下对全齿复活线虫的捕食率测定结果分别为：温泉６３．３０％，土壤６２．７３％，淡水６１．５０％，差异不显著，这是否说明同一地区不同生境捕食线虫真菌的捕食能力趋同，还有待对更多不同生境同种捕食线虫真菌捕食率进行比较后方可确定。莫明和等［１５］测定了少孢节丛孢对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）和拟松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）的捕食率，测定结果分别为３１．１５％和３１．１２％，鄢小宁等［１１］发现少孢节丛孢ＨＮＱ１１菌株在２５ ℃条件下对松材线虫幼虫的捕食率高达８７％，表明不同地区分离到的少孢节丛孢对同种或不同线虫的捕食效率都存在较大差异，在生防菌株的选择上要充分考虑到菌株的地区差异性及线虫的种类差别。
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