景 江，吴菊珍，周 筝，彭明江，陈章达
（成都工业学院， 成都 ６１００００）
摘要：研究了不同浓度的乙酰胺对念珠藻１０６（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． １０６）在对数期、稳定期和生长末期的影响。研究结果表明加入一定浓度的乙酰胺对蓝藻生长有一定的刺激作用。测定叶绿素ａ、藻胆蛋白含量、ＳＯＤ含量、ＡＴＰ含量等生长代谢指标，表明加入浓度为１、２和５ ｍｇ／ｍＬ的乙酰胺不同程度地延缓了念珠藻Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． １０６的衰亡，浓度５ ｍｇ／ｍＬ的乙酰胺增加了念珠藻Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ． １０６在生长对数期的时间。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：乙酰胺；叶绿素ａ；藻蓝蛋白；念珠藻１０６（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．１０６）
中图分类号：Ｑ９４５ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1699-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.043
蓝藻是水生生态系统中的重要组成部分，对整个水生态系统的平衡和稳定起着重要的作用。蓝藻的大量生长恶化水体的通风及光照条件、抑制水体中浮游生物有益种类的生长繁殖、阻碍水中植物的光合作用，挤占其他水生生物的生存空间［１］。蓝藻生命力强，越冬期生活在湖泊的底泥中，遇到适合其生长的外部环境条件如光照、温度、溶解氧（ＤＯ）等时，再次复苏［２］。念珠藻作为蓝藻一个代表种，属于水华爆发中的常见藻种。
近年来，有许多关于湖泊富营养化与蓝藻爆发相互作用的报道，但就某类污染物对蓝藻生长影响的具体研究较少。前期试验发现工业废水中的酰胺类物质可能是蓝藻爆发与疯长的原因之一。乙酰胺（ａｃｅｔａｍｉｄｅ）别名醋酰胺，是有机氟杀虫农药氟乙酰胺中毒的解毒药，可用作对水溶解度低的一些物质在水中溶解时的增溶剂，如纤维工业中常用乙酰胺作染料的溶剂和增溶剂。因此随着工业废水的排放，每年有大量的乙酰胺进入湖泊、河流等自然水体中。本研究就乙酰胺对念珠藻１０６（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．１０６）生长周期的影响进行了研究，对比不同浓度的乙酰胺对念珠藻１０６（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．１０６）在对数期、稳定期和生长末期的影响。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
藻种：念珠藻１０６（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．１０６）由中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库（ＦＡＣＨＢ）提供。ＢＧ－１１培养基，用以培养Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．１０６。培养温度为２５ ℃， 可见光照度２ ０００ ｌｘ，ｐＨ ６．８，培养至对数生长期。
乙酰胺：由成都科龙化工试剂公司提供（分析纯ＡＲ）。
其余所用试剂均为分析纯（ＡＲ）。
试验仪器：ＬＲＨ-２５０型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、可见分光光度计７２１Ｇ（上海精密科学仪器有限公司）、ＪＹ９２-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）、高速台式离心机。
１．２ 乙酰胺对蓝藻生长周期的影响试验
分别将对数期的念珠藻１０６（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．１０６）接种于４个１ ０００ ｍＬ锥形瓶中，藻液接满１ ０００ ｍＬ。１号为空白对照试验，２号加入乙酰胺浓度为１ ｍｇ／ｍＬ，３号加入乙酰胺浓度为２ ｍｇ／ｍＬ，４号加入乙酰胺浓度为５ ｍｇ／ｍＬ。每天光照１０ h、曝气２４ h、磁搅拌力器搅拌，试验温度２５ ℃， ｐＨ ６．８，每隔２４ ｈ定点取样分析。
１．３ 叶绿素ａ（Ｃｈｌ ａ）的测定
每隔２４ ｈ定时取５ ｍＬ（定为Ｖ１）藻液于１０ ｍＬ离心管中，在超声破碎仪上破碎３０ ｓ，工作时间１ ｓ，间隔２ ｓ，然后在样品中加入２０ μＬ １％（质量分数）的ＭｇＣＯ３溶液，于８ ０００ ｒ／ｍｉｎ下离心１５ ｍｉｎ，弃去上清液［3］。在沉淀中加入３ ｍＬ丙酮溶液，于４ ℃冰箱中过夜萃取１８～２４ ｈ，于７ ０００ ｒ／ｍｉｎ下离心１０ ｍｉｎ，取上清液于７ ｍＬ离心管中，分别测定７５0，６６３，６４５ 和６３０ ｎｍ的吸光度（OD），取７ ｍＬ离心管中上清液的体积为Ｖ２，利用下式计算Ｃｈｌ ａ （ｍｇ／ｍＬ）：
叶绿素ａ含量＝［１１．６４×（ＯＤ６６３ ｎｍ－ＯＤ７５０ ｎｍ）－２．１６×（ＯＤ６４５ ｎｍ－ＯＤ７５０ ｎｍ）＋０．１（ＯＤ６３０ ｎｍ－ＯＤ７５０ ｎｍ）］Ｖ２／Ｖ１
１．４ 藻蓝蛋白（Ｃ－ＰＣ）含量的测定
参照Ｐａｄｕｌａ的方法［4］，在分光光度计下测量藻蓝蛋白在６２０和６５０ ｎｍ的ＯＤ，用以下公式计算Ｃ－ＰＣ（ｍｇ／Ｌ）：
Ｃ－ＰＣ＝（１６６×ＯＤ６２０ ｎｍ）－（１０８×ＯＤ６５０ ｎｍ）
１．５ 藻密度的吸光度值
超声破碎，用分光光度计（７２１Ｇ）在６８０ ｎｍ下测量藻液的吸光度值［5］。
１．６ 超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的测定
于２５ ℃，在４．５ ｍＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ４缓冲液中加入待测的样品ＳＯＤ粗酶液，再加入１０ μＬ ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ联苯三酚，迅速摇匀，将摇匀的反应液立即倒入光径为１ ｃｍ的比色杯内，分光光度计３２５ ｎｍ波长下每隔３０ ｓ测ＯＤ一次，要求连苯三酚的自氧化速率控制在 ＯＤ０．０７／ｍｉｎ左右，对照管取１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ代替［6］。
测得数据按下式计算ＳＯＤ活性（Ｕ／ｍＬ）：
ＳＯＤ活性＝［０．０７－ＯＤ３２５ ｎｍ／ｍｉｎ］／０．０７×１００％／５０％×反应液总体积×样液稀释倍数／样液体积。
１．７ ＡＴＰ含量的间接测定法
采用间接测定的改进法［7］，取２０ ｍＬ藻液，在８ ０００ ｒ/ｍin下离心１０～１５ ｍｉｎ，弃去上清液，沉淀用少量蒸馏水溶解（２～３ ｍＬ）。将上述沉淀溶解液加入消解罐中，再向其中加入５ ｍＬ质量分数为９５％的 浓硫酸。旋紧罐塞，在消解仪器中进行消解，消解完毕冷却至室温。然后旋开罐塞，向罐中加入１～２滴Ｈ２Ｏ２，摇匀，用蒸馏水稀释至１０ ｍＬ，此即为消化液。将上述消化液取３ ｍＬ加入２５ ｍＬ的比色管中，在另一管中加３ ｍＬ蒸馏水为对照，再向两管中均加入３ ｍＬ定磷试剂，同置于４５ ℃水浴２５ ｍｉｎ。取出比色管冷至室温，在７２２Ｎ型分光光度计上６６０ ｎｍ处比色测定ＯＤ（用ＯＤ反映ＡＴＰ含量大小）。定磷试剂的配置：按体积比例，蒸馏水２份、质量分数为２．５％的钼酸铵１份、质量分数为１０％的抗坏血酸１份、质量分数为６５．３３％的硫酸１份，混合。
２ 结果与讨论
２．１ 念珠藻１０６叶绿素ａ含量变化
叶绿素ａ是蓝藻光合作用不可缺少的催化剂，其含量的多少直接反应了蓝藻生长代谢的活性［８］（图１）。加入乙酰胺浓度为１、２和５ ｍｇ／ｍＬ样品的叶绿素ａ明显高于空白样。乙酰胺对念珠藻的生长有一定的促进作用。在对数初期，加入乙酰胺藻样和空白藻样区别不明显。进入生长稳定期，空白藻样和乙酰胺浓度为１、２ ｍｇ／ｍＬ的藻样叶绿素ａ含量基本稳定，而乙酰胺浓度５ ｍｇ／ｍＬ的藻样叶绿素ａ含量继续保持增长，仍然处于生长对数期。由此可见，加入浓度５ ｍｇ／ｍＬ乙酰胺对念珠藻１０６（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．１０６）的生长产生一定的刺激作用。其生长对数期持续时间较空白样品更长，其光合作用的速率较空白样品更高，其细胞生长代谢活性较空白样品更强，从而提高了蓝藻水华爆发的概率。
２．２ 乙酰胺对念珠藻１０６生长速度的影响
由图２所示，加入乙酰胺浓度１、２和５ ｍｇ／ｍＬ的样品藻密度比空白样高。进入生长稳定期，加入乙酰胺浓度１、２ ｍｇ／ｍＬ的样品藻密度区别不明显。而加入５ ｍｇ／ｍＬ的样品藻密度高于空白样品５７％，表明其蓝藻个体数量较空白样品多，所能占用的水生资源与营养比空白样品多，为蓝藻的大量繁殖生长提供了基础。
２．３ 乙酰胺对念珠藻１０６藻蓝蛋白（Ｃ－ＰＣ）含量的影响
藻蓝蛋白与叶绿素ａ在蓝藻的光合作用中起着同等重要的作用，是藻类细胞中光合作用的一部分，将补获的光能传递给叶绿素ａ［９］。
由图３所示，进入生长末期，加入乙酰胺浓度为１、２和５ ｍｇ／ｍＬ样品的藻蓝蛋白含量与对照差异显著，而浓度５ ｍｇ／ｍＬ乙酰胺样品藻细胞内Ｃ－ＰＣ含量较高，体内活性蛋白较多，表明光合作用系统较完整。
２．４ 乙酰胺对念珠藻１０６ ＳＯＤ含量的影响
在叶绿体中，超氧自由基的清除是通过ＳＯＤ酶来催化完成的，当这种清除体系遭到破坏时，导致 ·O2-积累，进而引起Ｈ２Ｏ２积累，导致膜脂质过氧化，从而破坏叶绿体结构，致使叶绿素含量下降，细胞生长受阻［１０］。由图4可见，在生长末期正常蓝藻细胞体内的ＳＯＤ含量减少了６７％，细胞内的抗氧化系统不能保持平衡，藻细胞的死亡速度远远大于生长速度。而浓度５ ｍｇ／ｍＬ的乙酰胺藻样ＳＯＤ含量减少了４３％， 基本能够维持抗氧化功能。
２．５ 乙酰胺对念珠藻１０６ ＡＴＰ含量的影响
ＡＴＰ可以指示微生物的生物量和活性。由图5所示，浓度５ ｍｇ／ｍＬ的乙酰胺藻样在生长末期ＡＴＰ含量比对数期下降了７０％，仍高于空白样；而浓度１和２ ｍｇ／ｍＬ的样品和对照样区别不明显。由此可见，浓度５ ｍｇ／ｍＬ的乙酰胺藻样在生长末期的细胞活性要高于对照样，延长了蓝藻的生命周期。
３ 结论
在生长对数期，加入浓度５ ｍｇ／ｍＬ的乙酰胺藻样，藻密度、叶绿素ａ含量都高于同期空白样品，乙酰胺对念珠藻１０６的生长有正面的刺激作用，延长了蓝藻的生长对数期时间，提高了蓝藻水华爆发的概率。
在生长末期，加入浓度５ ｍｇ／ｍＬ乙酰胺的藻细胞叶绿素ａ、Ｃ－ＰＣ、ＳＯＤ和ＡＴＰ含量都高于空白样品，表明该浓度乙酰胺间接延缓了念珠藻１０６的衰亡，延长了蓝藻正常生命周期的时间，提高了蓝藻细胞的活性，增加了蓝藻水华爆发的强度。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 盛建武，何 苗，施汉昌，等．水环境中微囊藻毒素检测技术研究进展［Ｊ］．环境污染与防治．２００６，２８（２）：１３２－１３７．
［２］ 郑宾国，罗兴章，张继彪，等．湖泊底泥中蓝藻越冬和复苏行为研究进展［Ｊ］．环境污染与防治，２０１１，３３（２）：８５－８９．
［３］ ＰＡＲＳＯＮＳ Ｔ Ｒ． Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｃ ｉｎ ｓｅａｗａｔｅｒ［Ｊ］． Ｍａｒ Ｒｅｓ， １９６３， ２１：１６４．
［４］ ＰＡＤＵＬＡ Ｍ， ＢＯＩＴＥＵＸ Ｓ， ＦＥＬＺＥＮＳＺＷＡＬＢ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ａｃｔｉｃ ｏｆ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ：Ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｂ： Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６，３２：１９－２６．
［５］ 郭美婷，胡洪营，陈 健，等．紫外线对铜绿微囊藻的抑制效果及特性研究［Ｊ］．环境科学，２０１１，３２（６）：１６０８－０６１３．
［６］ 李小路，潘慧云，徐 洁，等．金鱼藻与铜绿微囊藻共生情况下的化感作用［Ｊ］．环境科学学报，２００８，２８（１１）：２２４３－２２４９．
［７］ 张道勇，赵勇胜，潘响亮，等．胞外聚合物（ＥＰＳ）在藻菌生物膜去除污水中Ｃｄ的作用［Ｊ］．环境科学研，．２００４，１７（５）：５２－５５．
［８］ 向 丽，邹 华，黄亚元，等．稻秆对铜绿微囊藻抑制作用的研究［Ｊ］． 环境工程学报，２０１１，５（２）：２７９－２８３．
［９］ 景 江，周 明，汪 星，等. Ｈ２Ｏ２与ＵＶ－Ｃ灭藻的协同效果研究及工程实验［Ｊ］，环境科学研究，２００６，１９（６）：５９－６３．
［１０］ 靳翠丽，周晓见，李 楠，等. 广玉兰提取物对铜绿微囊藻抑制作用的机制研究［Ｊ］．环境污染与防治，２０１１，３３（５）：５０－５３．