吴 辉，潘梦武，高易宏，李建文，姚少林，孙文秀
（长江大学生命科学学院，湖北 荆州 ４３４０２５）
摘要：采用平板稀释法和平板对峙试验，从武汉、荆州、宜昌和荆门等地的辣椒根际土壤中分离到１８５株细菌，筛选到１株具有高效拮抗辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）的生防菌Ｂｓ０４。通过形态学观察、生理生化指标测定、１６Ｓ ｒＤＮＡ序列测定及进化树构建，确定菌株Ｂｓ０４为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。Ｂｓ０４对辣椒疫霉菌丝生长抑制率达８０％，同时对烟草黑胫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ f.sb． ｖｅｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）和黄瓜立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）具有明显的抑制作用。利用光学显微镜观察Ｂｓ０４对辣椒疫霉菌丝形态的影响，发现菌丝分支增多、顶端畸形、原生质浓缩及生长缓慢等现象，表明Ｂｓ０４具有显著的抑菌作用。
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关键词 ：辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）；生防菌；鉴定；抑菌机理
中图分类号：Ｓ４３６ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1596-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.016
辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）引起，是重要的辣椒根茎病害之一，在中国及世界其他国家辣椒生产区发生严重，给辣椒生产造成巨大的经济损失。对于辣椒疫病的防治大多采用化学防治，而大量使用化学药剂导致了环境的严重污染，对消费者的身体健康产生了不利影响。目前，由于辣椒抗疫病品种较少，且多为中抗或不耐病品种，难以有效地控制辣椒疫病。因此，寻找安全有效的防治措施成为控制辣椒疫病的一个亟待解决的问题。
植物病害的生物防治是利用有益生物和生物代谢产物对植物病害进行有效防治的技术与方法，具有无毒、无害、无污染和高效等优点，受到了研究者的青睐。关于辣椒疫病的生物防治国内外均有相关研究报道［１－４］，但主要集中在生防菌的防效和应用上，对其控病机理研究却较少。在此基础上，针对湖北省辣椒疫病发生严重的状况，本研究从辣椒根际土壤中分离生防菌株，并对其进行鉴定，初步探讨生防菌的抑菌机理，为有效地防治辣椒疫病奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 供试菌株和培养基
辣椒疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）、烟草黑胫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ ｖａｒ． ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ f.sb． ｖｅｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）、黄瓜立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）均由长江大学生命科学院实验室保存。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基（ＮＡ）、马铃薯葡萄糖培养基（ＰＤＡ）。
１．２ 土样采集和处理
从武汉、荆州、宜昌和荆门等辣椒种植区疫病发生严重的田地，利用五点采样法从生长健康辣椒根际采集土样。采样时铲去表层５ ｃｍ土层，取新鲜土样５００ ｇ，用保鲜袋保存。称取土样１０ ｇ加入装有９０ ｍＬ无菌水的三角瓶中（内装玻璃珠若干），３０ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ振荡３０ ｍｉｎ，静置后获得土壤悬液。
１．３ 生防细菌的筛选
将土壤悬液稀释成１０－５、１０－６、１０－７浓度，吸取不同稀释度的土壤悬液１００ μＬ涂布于ＮＡ培养基上，置于２８ ℃培养４８ ｈ，挑取颜色、形态等不同的细菌单菌落并纯化、保存。采用平板对峙法测定分离到的细菌对辣椒疫霉的抑菌活性。将辣椒疫霉菌在ＰＤＡ平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块（直径６ ｍｍ），接种到ＰＤＡ平板中央。培养１ ｄ后，在距离辣椒疫霉菌块２ ｃｍ处的４个对接点接种待测细菌，２８ ℃培养，５ ｄ后观察抑菌结果，每个处理设３次重复。
１．４ 拮抗菌株的鉴定
将筛选到的抑菌效果较好的菌株进行菌落形态观察、显微形态观察、革兰氏染色、芽孢染色、水解淀粉试验、甲基红试验（Ｍ．Ｒ）、Ｖ．Ｐ试验、柠檬酸盐试验、接触酶反应试验、明胶液化试验、运动性试验等主要形态和生理生化指标鉴定［５，６］。参照文献［７］方法提取疑似枯草芽孢杆菌基因组ＤＮＡ。根据已报道的枯草芽孢杆菌１６Ｓ ｒＤＮＡ的保守区序列设计引物ＢｓＦ（５′－ＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ－３′）和ＢｓＲ（５′－ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧ－３′），以枯草芽孢杆菌疑似株基因组为模板，进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性４ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５４ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃ 延伸１ ｍｉｎ，共３０个循环；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经试剂盒纯化后测序，将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的序列进行对比分析，利用ＭＥＧＡ４．１软件构建进化树。
１．５ 拮抗菌株的抑菌谱试验
拮抗菌对各试验病原真菌的拮抗作用均采用平板对峙法，各试验重复３次。２８ ℃下培养５ ｄ后，测量抑菌带的宽度和菌落半径，计算拮抗菌对病原真菌生长的抑制率。对病菌生长的抑制率＝（对照菌落半径－处理菌落半径）／对照菌落半径×１００％。
１．６ 拮抗菌株对辣椒疫病菌菌丝形态的影响
将辣椒疫病菌在ＰＤＡ培养基上接种培养３ ｄ后，用打孔器打取直径５ ｍｍ的菌块置于盛有２０ ｍＬ ＰＤA培养基的无菌培养皿中，２８ ℃培养２ ｄ。将培养好的辣椒疫病菌菌块分别用拮抗菌株的无菌培养滤液和菌体悬浮液处理２４ ｈ后，以无菌水处理为对照，挑取菌丝在倒置显微镜下观察其形态，每处理重复３次。
２ 结果与分析
２．１ 拮抗细菌的筛选结果
从健康辣椒根际土壤中共分离到１８５株细菌，从中挑取菌落形态、颜色与枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）相似的细菌４８株。采用平板对峙法测定上述４８株细菌的抑菌活性，结果表明有２９株能够抑制辣椒疫霉的生长，但抑菌程度不同。其中抑菌圈直径为７．０～８．０ ｍｍ的有１株，为５．０～７．０ ｍｍ的有６株，为３．０～５．０ ｍｍ的有２２株。编号为Ｂｓ０４的菌株抑菌效果最强（图１）。
２．２ 拮抗菌株Ｂｓ０４的鉴定结果
２．２．１ 形态学和生理生化指标 菌株Ｂｓ０４在ＮＡ平板上培养２ ｄ后，菌落圆形或椭圆形，乳白色，中央凹陷，表面干燥，有褶皱，不透明。菌体为杆状，大小为（０．７~０．８） μｍ×（２．０~３．０） μｍ，革兰氏染色阳性，其他生理生化指标鉴定结果见表１。
２．２ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列与同源性分析 以拮抗菌株Ｂｓ０４的基因组ＤＮＡ为模板，用ＢｓＦ和ＢｓＲ为引物，进行ＰＣＲ扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测到１条大小约１ ５００ ｂｐ的清晰条带（图２），测序结果为１ ５３８ ｂｐ。将测序结果在ＮＣＢＩ ＧｅｎBａｎｋ上进行序列比对（比对号ｌｃｌ２８０１７），发现其与枯草芽孢杆菌１６Ｓ ｒＤＮＡ序列的相似性高达９９％，初步确定拮抗菌株Ｂｓ０４为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。将菌株Ｂｓ０４的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列上传ＧｅｎBａｎｋ，获得基因序列号ＫＦ７２５６３６，并利用ＭＥＧＡ４．１软件进行聚类分析，构建进化树。由图３可知，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＫＦ７２５６３６）与Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＫＣ５０６７７８．１）处于一个小分支，同时与另外两个枯草芽孢杆菌位于一个大分支。由此，进一步表明拮抗菌株Ｂｓ０４为枯草芽孢杆菌。
２．３ 对其他病原真菌的拮抗作用
为了研究拮抗菌株Ｂｓ０４的生防潜力，采用平板对峙法对其抑菌谱进行了测定。结果表明，拮抗菌株Ｂｓ０４对供试病原真菌有较高的拮抗活性。由表２可知，拮抗菌株Ｂｓ０４对辣椒疫霉菌、烟草疫霉菌的抑制率达７０％以上，对其他病原真菌的抑制率也在４０％以上。表明菌株Ｂｓ０４的抑菌谱宽，生防潜力较大，具有良好的应用前景。
２．４ 对辣椒疫霉菌菌丝形态的影响
由图４可知，用去离子水处理的辣椒疫霉菌丝形态饱满，细胞壁光滑，菌丝能正常生长并扩展（图４ａ）。经拮抗菌株Ｂｓ０４菌体悬浮液和无菌滤液处理后，辣椒疫霉菌丝形态发生明显变化，菌丝分支增多，顶端出现畸形，生长缓慢（图４ｂ与图４c）；大多数菌丝还出现了细胞壁加厚，原生质浓缩呈球形或椭圆形的现象，菌丝中间出现许多类似厚壁孢子的细胞（图４d）。
３ 小结与讨论
近年来，辣椒疫病发生日益严重，给中国的农业生产造成了较大的危害。对于辣椒疫病的防治，长期以来使用化学农药进行防治，导致农药残留污染、增强病原菌的抗药性等不利影响。辣椒疫病作为典型的土传病害，应用生防菌对其进行防治则显得至关重要。芽孢杆菌是一类重要的用于土传性病害的生防细菌。多粘类芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌［８］等能够抑制多种病原菌的生长，对其引起的病害起到一定的防治作用。
枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，具有生长快、营养要求简单、对人畜无害、能够抑制多种植物病害、不易产生抗药性等优点，是目前应用广泛的生防菌［９］。枯草芽孢杆菌能够有效抑制玉米串珠镰孢菌［１０］、棉花枯萎病菌［１１］、稻瘟病菌［１２］等，其抗菌谱较广。本研究通过平板稀释法从辣椒根际土壤中分离到了枯草芽孢杆菌Ｂｓ０４，采用平板对峙法发现其对辣椒疫霉菌具有较强的拮抗作用，且对其他多种病原真菌具有明显的抑菌作用，具有较广的抗菌谱，这与前人的研究结果一致［１３－１５］。同时，枯草芽孢杆菌Ｂｓ０４显著影响辣椒疫霉菌丝形态，能抑制菌丝的生长和扩展，阻止病原菌的进一步侵染。枯草芽孢杆菌作为目前应用较为广泛的生防细菌之一，其主要通过根际定殖、分泌抗生素及拮抗蛋白等达到防病目的。本研究中菌株Ｂｓ０４的防病机理有待进一步研究，而对于其在生产上的应用效果还有待于深入探索。
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