袁红慧1，程 华１，李琳玲１，陈小玲１，程水源２
（１．黄冈师范学院生命科学学院，湖北 黄冈 ４３８０００； 2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023）
摘要：以前期获得的银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ．）ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列为模板，通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到ＧｂＭＥＣＴ翻译起始位点上游９８２ ｂｐ的启动子序列，研究银杏ＭＥＣＴ基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明，该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件，主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件ＴＧＴＣＡ序列、抗损伤应答元件ＥＲＦ３和热激响应元件ＨＳＥ等。此外，在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件，充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。
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关键词 ：银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ．）；染色体步移；２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓醇－４－磷酸胱氨酰转移酶基因；调控元件
中图分类号：Ｓ７９２．９５ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０７－1746－０5
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.055
在银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ．）萜内酯合成的ＭＥＰ途径中，ＭＥＣＴ （２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭＥＰ ｃｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是其第三步反应的催化酶，催化２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓醇－４－磷酸（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ－４－ｏｈｏｓｐｈａｔｅ， ＭＥＰ）形成４－（胞苷５－焦磷酸）－２Ｃ－甲基赤藓糖［４－（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ５－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ）－２Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ，ＣＤＰ－ＭＥ］，并最终形成合成萜内酯的前体物质，因此ＭＥＣＴ是调控萜类物质合成的一个关键酶。目前，已经从银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ．Ｌ）［１］、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）［２］、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）［３］、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）［４］、水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）［５］、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）［６］、火炬松（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）［７］等多种植物中克隆了ＭＥＣＴ基因。
研究发现，在ＤＮＡ水平上，银杏ＭＥＣＴ基因与拟南芥和水稻ＭＥＣＴ基因相似度分别达到了７０．７％和７０．２％。尽管已从多种植物中获得ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列，但目前关于该基因启动子表达调控方面的研究报道较少，尤其缺乏对该基因启动子的基本结构和功能分析方面的探究，本试验通过染色体步移法克隆银杏ＭＥＣＴ基因的启动子，初步分析该启动子所含的调节元件和作用特点，旨在为启动子下一步的功能分析提供可靠依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
银杏幼叶采自黄冈师范学院银杏苗圃园，品种为家佛手１４年生实生苗。采后自封袋封装，于－８０ ℃冰箱中冷冻保存。试验所用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ｔｏｐ１０为经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存。
１．２ 试验试剂
各种限制性内切酶、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ产物克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、ｄＮＴＰ、ＤＬ２０００、Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ和Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ均购自大连宝生物工程有限公司；ＤＮＡ回收试剂盒为Ａｘｙｇｅｎ公司产品。各种寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。
１．３ 试验方法
１．３．１ 银杏ＤＮＡ提取 采用改良的ＣＴＡＢ法［８］大量提取银杏基因组ＤＮＡ。
１．３．２ 基因组酶切与连接 用平末端限制酶ＥｃｏＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＳｓｐⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳｔｕⅠ、ＨｐａⅠ、ＳｃａⅠ和ＳｍａⅠ分别进行单酶切，３７ ℃酶切过夜（８ ｈ），各取５ μＬ用０．８％的琼脂糖电泳检测是否酶切完全，酶切产物分别纯化回收；回收后与各自的接头连接，体积为５０ μＬ。连接反应体系为ＤＮＡ酶切产物（模板）３０ μＬ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ （１０×） ５ μＬ、接连体１０ μＬ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ３ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ２ μＬ，反应程序为１６ ℃连接１２ ｈ。
１．３．３ 引物设计及染色体步移扩增 根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ提交的银杏ＭＥＣＴ基因ｃＤＮＡ序列（登录号ＤＱ１０２３６０）分别设计引物ＭＴ１、ＭＴ２（表１），与２个接头引物ＡＰ１、ＡＰ２形成巢式引物，进行第一次步移扩增。将得到的目的片段连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，送出测序。根据第一次扩增的启动子序列，继续设计引物ＭＴ３、ＭＴ４（表１）进行了第二次步移并测序。
１．３．４ 目的片段回收、片段与载体连接、转化及测序 根据琼脂糖电泳检测扩增结果，采用胶回收试剂盒回收所需的目的片段。所用的Ｔ载体为ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ，之后与回收片段连接，并转化大肠杆菌进行鉴定和筛选，将含有目的基因重组子的菌株送去测序。
１．３．５ 生物信息学分析 用ＤＮＡＭＡＮ等生物学软件对序列进行处理，然后将测序获得的启动子序列提交至ＰＬＡＣＥ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ/ＰＬＡＣＥ/）进行在线分析，预测启动子序列保守区域中潜在的顺式作用元件。通过ＭｃＰｒｏｍｏｔｅ在线工具预测其转录起始位点。
２ 结果与分析
２．１ 银杏ＭＥＣＴ基因启动子序列克隆及验证
将银杏基因组用８个平末端限制性内切酶（ＥｃｏＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＳｓｐⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳｔｕⅠ、ＨｐａⅠ、ＳｃａⅠ和ＳｍａⅠ）分别进行消化，酶切产物加上接头后作为模板与其特异性引物进行步移扩增，经２轮ＰＣＲ后，电泳检测结果如图１所示，在ＳｃａⅠ的酶切体系中得到了５００ ｂｐ左右的ＰＣＲ产物，将产物回收并测序。在第一次步移得到的上游启动子序列（图１Ａ）的５′端设计两个下游引物，继续进行第二次步移扩增，图１Ｂ即为第二次扩增结果。将２次步移的产物在Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ软件中进行序列拼接比对，得到了长９８２ ｂｐ的目的片段，通过分析比较证实该片段３′端序列与ＭＥＣＴ基因ｃＤＮＡ序列的５′端部分片段重合一致，说明获得的序列为银杏ＭＥＣＴ基因上游启动子的部分片段。
２．２ 银杏ＭＥＣＴ基因启动子区域序列的生物信息学分析
银杏ＭＥＣＴ基因启动子序列如图２所示，通过ＭｃＰｒｏｍｏｔｅ预测其转录起始位点可能为位于９８２ ｂｐ处的碱基Ａ，将此位点标记为＋１。ＴＡＴＡ-ｂｏｘ位于上游－１０６ ｂｐ处，ＣＡＡＴ-ｂｏｘ位于－１５０ ｂｐ处，该启动子序列上含有多种对光照、干旱、伤害、金属离子和细胞周期诱导响应的启动子元件，也含有一些组织特异性启动子元件，依据ＰＬＡＣＥ ｄａｔａｂａｓｅ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ． ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／）分析结果已将部分作用元件在图示中做了标记。
２．２．１ 光调控元件 分析发现银杏ＭＥＣＴ启动子序列含有多个与光调节相关的调控元件，如ＧＡＴＡ－ｂｏｘ （ＧＡＴＡ）、ＧＴ－１（ＧＲＷＡＡＷ）等，ＧＴ－１存在于许多光调节基因中，是ＧＴ－１转录因子结合的保守位点；另有Ｉｎｒ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＹＴＣＡＮＴＹＹ）、ＡＳＦ１（ＴＧＡＣＧ）及Ｉ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡＡ）等均是与光响应有关的顺式元件（表２）。
２．２．２ 抗逆境胁迫及与激素响应相关的调控元件 从预测结果分析来看，有些启动子元件既能响应逆境胁迫同时也与激素调节有关，说明逆境胁迫与激素调节存在一定的交叉作用，两者互相关联，体现了启动子作用元件之间的互作性和复杂性。表３中有大量响应激素调节的顺式元件，与细胞分裂素相关的ＡＲＲ１（ＮＧＡＴＴ）８个，ＣＰＢＣＳＰＯＲ（ＴＡＴＴＡＧ）３个，是依赖细胞分裂素的蛋白质结合位点；与脱落酸响应相关的元件有ＭＹＣ（ＣＡＮＮＴＧ）和ＭＹＢ１ＡＴ（ＷＡＡＣＣＡ）２种，其中ＭＹＣ元件有６个；该序列中响应赤霉素的顺式元件较多，其中ＷＲＫＹ（ＴＧＡＣ）是一种赤霉素信号途径的转录抑制子，此类型的调节元件共６个，此外还有ＴＡＴＣＣＡ序列、ＣＡＲＥｓ （ＣＡＡＣＴＣ）、ＧＡＲＥ（ＴＡＡＣＡＧＡ）和ＧＡ（ＴＡＡＣＡＡＲ）；另有２种与生长素作用相关的元件ＡＳＦ－１ （ＴＧＡＣＧ）、ＣＡＴＡＴＧ序列；与乙烯作用相关的元件仅有１种ＡＣＳ（ＴＡＡＡＡＴＡＴ）。响应逆境胁迫的元件有：抗病虫害响应元件ＴＧＴＣＡ、抗损伤元件ＥＲＦ３ （ＴＧＡＣＹ）、热激响应元件ＨＳＥ（ＣＣＡＡＴ）及防卫基因的诱导元件Ｗ－ｂｏｘ（ＣＴＧＡＣＹ）。
２．２．３ 其他类型调控元件 除对光、激素及逆境胁迫相关的元件外，银杏ＭＥＣＴ启动子序列中还存在以下特异性元件：根组织特异性元件ｒｏｌＤ（ＡＴＡＴＴ）、与苯丙氨酸和木质素代谢相关的元件ＭＹＢＰＬＡＮＴ（ＭＡＣＣＷＡＭＣ）、受糖抑制作用的元件ＳＲＥ（ＴＴＡＴＣＣ）、氧胁迫和铜离子响应元件ＣｕＲＥ（ＧＴＡＣ）、淀粉酶响应元件ａｍｙｌａｓｅ－ｂｏｘ（ＴＡＴＣＣＡＴ） 等，详见表４。
３ 小结与讨论
本试验通过设计特异性引物，采用染色体步移的方法克隆了ＭＥＣＴ基因翻译起始位点上游９８２ ｂｐ的启动子序列，对其调控区域进行了生物信息学分析。分析结果表明，银杏ＭＥＣＴ基因启动子中含有光响应元件ＧＡＴＡ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡ）、ＧＴ－１（ＧＲＷＡＡＷ）及Ｉ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡＡ）等，其中ＧＡＴＡ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡ）是捕光叶绿素ａ／ｂ蛋白复合体基因（ｃａｂ）中大量存在的光应答元件，ｃａｂ即是典型的光依赖型基因。通常ＧＡＴＡ－ｂｏｘ（ＧＡＴＡ）作为一种光开关（Ｌｉｇｈｔ ｓｗｉｔｃｈｅｓ）存在于植物基因启动子中。ＧＴ－１ （ＧＲＷＡＡＷ）存在于某些光诱导启动子中，但也可在不显示光效应的启动子中存在，并且在某些光诱导启动子中，ＧＴ－１ 缺失也不会完全丧失光调节特性。因此，ＧＴ－１在光调节表达中可能不是必需的。Ｉ－ｂｏｘ是光调节所必需的调控元件，若缺失或突变都会导致启动子光诱导能力下降，在水稻Ｏｓｒｂｃｓ［９］、番茄ＰＳＹ［１０］、豌豆ｒｂｃＳ［１１］等基因启动子中都存在。
在银杏ＭＥＣＴ基因启动子中还含有各种激素响应元件，与细胞分裂素相关的ＡＲＲ１（ＮＧＡＴＴ）元件在作用过程中能与转录因子ＡＲＲ１结合，是植物对细胞分裂素的应答调节因子［１２］。脱落酸响应相关的元件ＭＹＣ（ＣＡＮＮＴＧ）、ＭＹＢ１ＡＴ（ＷＡＡＣＣＡ）也与逆境胁迫诱导相关，推测当植物处于脱水、干旱等逆境胁迫条件时，ＭＹＢ、ＭＹＣ可作为转录因子结合位点，以某种方式促进脱落酸等植物内源激素合成，通过落叶、促进休眠等方式减少养分和水分消耗，以起到抗胁迫作用，维持植物正常生命活动。由此发现，许多响应逆境胁迫的元件同时也是某些激素的响应元件，如ＡＳＦ－１（ＴＧＡＣＧ）既是生长素的应答元件同时也是一种抗病害的响应元件。该启动子中还含有热激响应元件ＨＳＥ（ＣＣＡＡＴ），这类热诱导启动子对刺激产生响应的延迟时间短、活性强，一般能快速对高温胁迫作出反应［１３］。
由序列分析的预测结果可知，在银杏ＭＥＣＴ基因启动子序列中含有许多重要的顺式作用元件。通过分析各种类型元件的作用特点，可以了解影响其作用的因素，从而对萜内酯合成的影响因素做出初步判定，为后面启动子的功能分析提供有效信息。
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