李 阳１，杨振飞１，马婷婷１，陈 涛２，龚传清２，李永辉２，李晓华１
（１．中南民族大学生命科学学院／生物技术国家民委重点实验室，武汉 ４３００７４；２．湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北 襄阳 ４４１００３）
摘要：以烟碱为惟一碳源，从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离得到１株烟碱降解菌，为蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）ＳＣＵＥＣ２。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ时，发酵１０ ｈ后烟碱降解率达到８８．８０％。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，烟碱质量浓度为６．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度为７．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率和菌株生长呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。ＳＣＵＥＣ２菌株发酵液经ＨＰＬＣ检测，结果显示，烟碱的保留时间为５．２５ ｍｉｎ左右，在培养到１６ ｈ时，烟碱峰峰面积明显减小，并在保留时间为１１．７９ ｍｉｎ左右处出现一个新色谱峰，表明有中间代谢产物产生。
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关键词 ：烟碱；生物降解；蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）；降解特性
中图分类号：Ｑ９３９．１１＋２；Ｓ５７２；Ｓ１５４．３ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1586-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.013
烟碱俗称尼古丁（ｎｉｃｏｔｉｎｅ），是烟草中的主要生物碱。烟碱对人体有害，很容易被人体吸收，是吸烟上瘾的主要物质，会引起人体的心血管疾病［１］。烟碱易溶于水，在烟草种植和香烟生产上很容易造成固体和液体的高浓度污染，严重污染环境和威胁人类健康。欧盟已将每千克烟碱含量超过５００ ｍｇ的烟草废弃物规定为“有毒有害物”，其他一些国家也规定了各自相应的标准［２，３］。因此，烟碱降解成为迫切需要解决的问题，而利用微生物降解烟碱是一种低成本、高效率且对环境影响小的方法［４］。近年来，微生物降解烟碱的研究受到关注，降解烟碱的微生物主要有嗜烟碱节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ）［５－８］、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）［３，９－１３］、中间苍白杆菌（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）［１，１４］、土壤杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）［１５－１７］、红球菌属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）［１８］、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）［１９］等。本研究从湖北省襄阳市烟草种植地土壤分离出１株新菌株蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ），具有较高的降解烟碱性能，通过对其降解性能进行研究， 旨在为降低烟叶和烟厂废弃物中烟碱含量提供依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．1．１ 样品 土壤样品采自湖北省襄阳市烟草种植地土壤。
１．1．２ 培养基 烟碱培养基：１３．３０ ｇ Ｋ２ＨＰＯ４，４．００ ｇ ＫＨ２ＰＯ４，０．１０ ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．００ ｇ酵母粉，１０．００ ｍＬ微量元素（１．００ ｇ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．４０ ｇ ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ，０．２０ ｇ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．２０ ｇ ＣｕＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．０２ ｇ ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，用０．１０ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液溶解定容至０．１０ Ｌ），用去离子水定容至１．００ Ｌ，自然ｐＨ。高压蒸汽灭菌后，加入一定量烟碱（用０．２２ μｍ滤膜过滤）。烟碱分离培养基：烟碱培养基中加入１．８％的琼脂。种子培养基：１０．００ ｇ胰蛋白胨，５．００ ｇ酵母浸粉，１０．００ ｇ ＮａＣｌ，先溶于０．９０ Ｌ去离子水，用５．００ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液调ｐＨ至７．００，再用去离子水定容至１．００ Ｌ。培养基１２１ ℃高压蒸汽灭菌２０ ｍｉｎ。
１．１．３ 主要试剂和仪器 烟碱（纯度≥９８％） 购自洛阳天科生物工程有限公司；ＵＶ－６１００ＰＣ紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００高效液相色谱仪（美国戴安公司）；ＨＺ－９２１１Ｋ空气恒温振荡器（太仓市华利达实验设备有限公司）；ＣＲ２２Ｇ高速冷冻离心机（日本日立公司）。
１．２ 烟碱降解菌的分离
称取２．００ ｇ土壤样品于２０．００ ｍＬ烟碱培养基，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养。用０．９０％生理盐水梯度稀释，涂布于烟碱分离培养基，于３０ ℃培养，挑取菌株划线分离纯化。分别将纯化的菌株接入烟碱培养基中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，测定发酵液中烟碱质量浓度。
１．３ 烟碱培养基中烟碱质量浓度的测定
将菌株接入烟碱培养基中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用不接菌的烟碱培养基作空白对照（ＣＫ）。发酵液在１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ ｍｉｎ，上清液用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液稀释到合适的吸光值范围。以０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ 溶液作参比，测定发酵液在紫外光波长为２５９ ｎｍ处的吸光值。烟碱降解率的计算公式为：
烟碱降解率＝（原培养液中烟碱质量浓度－发酵液中烟碱质量浓度）／原培养液中烟碱质量浓度×１００％
１．４ 菌体生长量的测定
将菌株接种至烟碱培养基中，在３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ条件下摇床培养，定时取样，采用分光光度法测定菌体的生长量和烟碱降解率，菌体生长量用Ｄ６００ ｎｍ表示。
１．５ 静止细胞的制备
将菌株接种于种子培养基中，在生长对数期转接到含有烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ的烟碱培养基中，生长对数期离心菌体并用ｐＨ ７．００的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４缓冲液洗３次备用［１２］。
１．６ 发酵液的ＨＰＬＣ检测
用０．２２ μｍ的水相膜过滤发酵液，ＨＰＬＣ检测，检测条件为：波长为２５９ ｎｍ，色谱柱为Ｃ１８柱（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流动相为甲醇（色谱纯）∶１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４＝２５∶７５（Ｖ／Ｖ），流速为０．５０ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为３０ ℃，进样量为２０．００ μＬ。
２ 结果与分析
２．１ 烟碱降解菌的分离与烟碱的测定
用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液将纯烟碱配制成浓度为５．００ ｇ／Ｌ的工作液，分别取工作液０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５和０．０６ ｍＬ，用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液定容至１０．００ ｍＬ，以０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液为参比，测定不同浓度烟碱溶液在２５９ ｎｍ处的吸光值。结果显示，烟碱浓度在０．００５～０．０３０ ｇ／Ｌ范围内时，吸光值（ｙ）与烟碱浓度（ｘ）呈正相关，线性回归方程为ｙ＝３５．０１４ ２９ ｘ＋０．０００ ０７，ｒ＝０．９９９ ９５。
将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养１０ ｈ，进行降解烟碱能力的测定，结果（图１）显示，未接种的烟碱培养基（ＣＫ）在２５９ ｎｍ处有吸收峰，而经ＳＣＵＥＣ２菌株培养１０ ｈ后，２５９ ｎｍ处吸收峰降低，表明ＳＣＵＥＣ２菌株具有烟碱降解能力。
２．２ 烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株的烟碱降解率与生长量的关系
将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基中，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，取样测定并计算发酵液的烟碱质量浓度和菌体浓度。结果（图２）显示，随着ＳＣＵＥＣ２菌株的生长，烟碱不断被降解，１０ ｈ后 ＳＣＵＥＣ２菌株生长量达到最大，此时降解率达８８．８０％，表明烟碱降解率和菌体生长量呈正相关。
２．３ 烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株对烟碱的耐受性
将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基中，烟碱质量浓度分别为５．００、６．００和７．００ ｇ／Ｌ，在３０ ℃下、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，取样测定并计算发酵液的烟碱降解率和菌体浓度。结果（表１）显示，烟碱质量浓度为５．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８０．８４％；烟碱质量浓度为６．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度７．００ ｇ／Ｌ时菌株生长被抑制，烟碱降解率呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。
２．４ 温度对烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株烟碱降解率和菌体生长量的影响
将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基中，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ，分别在２０、２５、３０、３７和４２ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养１２ ｈ，取样测定并计算发酵液的烟碱降解率和菌体浓度，结果（表２）显示，温度为３０ ℃时，烟碱降解率和菌体生长量最大；当温度低于３０ ℃时，烟碱降解率和菌体生长量随温度的升高而增大，但影响较小；当温度大于３７ ℃时，菌株的生长受到抑制，烟碱降解率和菌体生长量随温度的升高呈快速下降的趋势。
２．５ 烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株中间代谢产物ＨＰＬＣ分析
将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株的静止细胞（Ｄ６００ ｎｍ为０．６０左右）以１０％的接种量接种至ｐＨ ７．００、烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４缓冲液中，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，定时取样，发酵液１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，用０．２２ μｍ的水相膜过滤，进行ＨＰＬＣ检测。结果（图３）显示，液体培养基中烟碱的保留时间在５．２５ ｍｉｎ左右。当培养到１６ ｈ时，５．２５ ｍｉｎ左右的烟碱峰面积明显减少，出现一个保留时间在１１．７９ ｍｉｎ左右的新色谱峰，表明培养基中的烟碱被降解，同时产生中间代谢产物。
３ 小结与讨论
本研究从湖北省襄阳市烟草种植地土壤中分离得到1株烟碱降解菌，为蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，当接种量为５％，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ时，发酵１０ ｈ后烟碱降解率达到８８．８０％。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，当接种量为５％，烟碱质量浓度为６．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度为７．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率和菌株生长呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株最适生长温度为３０ ℃并对高温较敏感，当温度高于３７ ℃时，菌株生长受到一定的抑制。
烟碱的毒性很高，目前国内外报道的降解烟碱微生物主要有烟草节杆菌、嗜烟碱节杆菌、氧化节杆菌、纤维单胞菌属、棒杆菌属、阴沟肠杆菌、烟草微球菌、假单胞杆菌、恶臭假单胞杆菌、中间苍白杆菌属等。本研究从湖北省襄阳市烟草种植地中分离得到烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株，该菌株具有高烟碱耐受力和高烟碱降解力，为利用生物技术降解烟碱废弃物和降低烟叶中烟碱含量奠定了基础。
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