付艳茹，须 健
（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 ４３００７０）
摘要：以体视镜拍摄的水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）中旱５号（ＺＨ５）和珍汕９７（ＺＳ９７）的主根照片为研究对象，利用图像分析软件Ｉｍａｇｅ Ｊ建立了一种全新的水稻根毛长度测量方法。在不同的培养时间和培养条件下，分别对位于水稻主根不同部位根毛的长度进行统计，得到一组最优的水稻根毛的测量方法和测量条件。用所建立的水稻根毛长度测量体系，对两组肉眼观察根毛长度无明显差异的水稻品种进行了测量，结果表明，此种方法可以检测出两个水稻品种间根毛长度的差异。
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关键词 ：水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）；根毛；长度测量；Ｉｍａｇｅ Ｊ软件
中图分类号：Ｓ５１１；ＴＰ３９１ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1722-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.049
水稻是单子叶植物的模式植物，也是重要的粮食作物。目前对于水稻地下部分的研究相对薄弱。根系是植物吸收外界水分、养分的主要器官，环境条件和栽培措施大多是首先通过影响根系的发育，进而影响到植株地上部分的生长。根毛是根的成熟区表皮细胞的细长突起。大部分被子植物的表皮细胞分为生毛细胞（Ｈ细胞）和非生毛细胞（Ｎ细胞）。以前一直认为水稻根毛是由表皮细胞不对称分裂后形成小的子细胞分化产生的，但近期的研究表明水稻根的表皮细胞是对称分裂的，根毛发达后生毛细胞比非生毛细胞的扩增速率快，导致根毛成熟时生毛细胞比非生毛细胞要小。生毛细胞比非生毛细胞的扩增速率快可能与生毛细胞是重要的吸收水分和营养的器官有关［１］。
Ｉｍａｇｅ Ｊ是由美国国立卫生研究院（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）开发的一个基于ＪＡＶＡ的图像处理软件，可以显示、编辑、分析、处理多种图片格式，由于其操作简单有效已经广泛地应用于各个领域［２－４］。本研究利用Ｉｍａｇｅ Ｊ软件首次建立了水稻根毛长度的测量方法，使准确、简便地量化水稻根毛的长度成为可能；利用所建立的根毛测量方法对两组肉眼所见根毛长度无明显差异的水稻品种进行测量，发现此种方法可以揭示出不同水稻品种间根毛长度的差异，从而证明了该测量体系的可行性和有效性，为进一步研究水稻根毛发育及其影响因素打下了量化分析基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
水稻：中旱５号（ＺＨ５）、珍汕９７（ＺＳ９７），由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。
１．２ 方法
１）１／２ ＭＳ培养基配制。培养基配方为：２．２ ｇ ＭＳ粉末、１０ ｇ蔗糖、０．５ ｇ ＭＥＳ（2-（N-吗啡啉）乙磺酸）、１０ ｇ琼脂，去离子水定容至１ Ｌ。调节ｐＨ至５．８，高温高压灭菌１５ ｍｉｎ后倒入 １３ ｃｍ×１３ ｃｍ透明的塑料方形培养皿中，凝固后备用。
２）种子灭菌及幼苗生长。将去掉颖壳的水稻种子分装在锥形瓶中，加入适量７５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇摇晃１ ｍｉｎ，弃去乙醇，加入０．１５％（m∶V）升汞摇晃１５ ｍｉｎ，弃去升汞，最后用灭菌水清洗３～５次。将灭过菌的水稻种子横向（胚背向培养基一侧）摆放在１／２ ＭＳ培养基上，每皿１０粒。将培养皿封口后竖直向后倾斜１５°～２０°放置，使根能贴在培养基表面生长。２８ ℃光／暗（１６ ｈ／８ ｈ）培养或 ２８ ℃暗培养２ ｄ或３ ｄ。
２ 结果与分析
２．１ 水稻根毛的图像采集
去掉水稻幼苗培养皿封口膜后背面朝上，用体视显微镜（Ｌｅｉｃａ Ｓ８ ＡＰＯ；ＣＣＤ：ＤＦＣ２９０）拍照，参数设置为：１×、曝光４４０．３、饱和度０．８５、伽玛１．８４、增益１．８４×。
２．２ 水稻根毛的测量
启动Ｉｍａｇｅ Ｊ软件，选择Ｆｉｌｅ→Ｏｐｅｎ（图１Ａ）打开所拍摄的水稻主根的体视镜图片；Ａｎａｌｙｚｅ→Ｓｅｔ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ（图１Ｅ）确定标尺；选择Ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ工具（图１Ｂ），默认设置，将所需测量的部位选定，按键盘上的“Ｃｔｒｌ＋Ｃ”键，将所选区域复制，Ｆｉｌｅ→Ｎｅｗ→Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｃｌｉｐｂｏａｒｄ，所复制的区域会作为一个独立的窗口出现；用Ｆｒｅｅｈａｎｄ工具，默认设置，将主根选中（图１Ｃ），选择Ａｎａｌｙｚｅ→Ｍｅａｓｕｒｅ（图１Ｄ）得到主根的面积；选择Ｉｍａｇｅ→Ｔｙｐｅ→８－ｂｉｔ（图１Ｆ）将图像调整为灰度模式；选择Ｉｍａｇｅ→Ａｄｊｕｓｔ→Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（图１Ｇ）通过拖动标杆（图１Ｈ）将根毛和主根选中，然后选择Ａｐｐｌｙ，选择Ａｎａｌｙｚｅ→Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（图１Ｉ）会弹出一个设置框，调整Ｓｉｚｅ（ｐｉｘｅｌ〈２）→１，Ｓｈｏｗ→Ｏｕｔｌｉｎｅｓ→ＯＫ，这时会输出根毛和主根的面积和（图１Ｊ）。根据公式：根毛的平均长度＝（根毛和主根的面积和－主根的面积）／（２×所选区域的长度），得到根毛的平均长度。
２．３ 水稻根毛测量方法的优化
以ＺＨ５和ＺＳ９７为材料，选取尖端（从距根毛起始处１ ｍｍ开始向上４ ｍｍ的区域，图２A白色箭头区域）、基部（从种子端开始向下４ ｍｍ的区域，图２B）和整体（基部和尖端根毛的平均值）的根毛长度进行统计。培养条件和时间也做了相应的改变，２８ ℃光／暗（１６ ｈ／８ ｈ）培养或 ２８ ℃暗培养２ｄ 或３ ｄ。
２．３．１ 培养条件的确定 在光、暗条件下培养２ ｄ，分别对根的尖端、基部和整体的根毛长度进行测量。结果表明，在光、暗条件下ＺＨ５和ＺＳ９７两个品种间各个部位的根毛长度差异都极显著，但在光培养条件下两个品种间尖端、基部、整体的Ｐ值（分别为４．００Ｅ－１１、４．０６Ｅ－０８、３．１３Ｅ－１２）远小于暗培养下两个品种间的Ｐ值（分别为５．３Ｅ－０４、２．２５Ｅ－０３、９．２Ｅ－０４），所以选定光培养为进行根毛长度测量的理想条件。
２．３．２ 培养时间的确定 分别光培养２ ｄ和３ ｄ，对根的尖端、基部和整体的根毛长度进行测量。结果表明，光下培养２ ｄ和３ ｄ时，ＺＨ５和ＺＳ９７两个品种间各个测量部位的根毛长度差异都极显著；但在光培养２ ｄ时ＺＨ５种内也有显著性差异（基部的根毛长度和整体的根毛长度相比其Ｐ值为０．０３９），表明光培养２ ｄ时根毛的长度尚未稳定，所以选定３ ｄ为测量根毛长度所需的培养时间。
２．３．３ 测量部位的确定 光培养３ d，ＺＨ５和ＺＳ９７种间根毛长度相比，各部位相比差异都极显著，尖端（Ｐ值为１．１９４ Ｅ－１２）的差异比整体（Ｐ值为６．７８３Ｅ－０９）和基部（Ｐ值为３．１２６Ｅ－０５）的要更为显著（图３，表１）；ＺＨ５和ＺＳ９７种内根毛长度相比，尖端和基部的根毛长度与整体相比差异都不显著（表１），所以可以用尖端的根毛长度来衡量水稻根毛的长度。
由上述结果可以得出，水稻根毛长度测量体系的条件为：水稻光培养３ ｄ，以尖端根毛的长度来衡量整体根的根毛长度。
２．４ 水稻根毛测量方法的应用
为了验证上述所建立的根毛测量体系是否切实可行，对图４中肉眼所见根毛长度无明显差异的两个水稻品种根毛长度进行了测量，其中A、B、C为同一品种，D、E、F为另一品种。结果显示，图４Ａ～Ｆ的水稻根毛长度分别为１４４．５９５、１７２．８０４、１９７．８４３、２９７．６４８、３５１．７８１、４０５．１５６ μｍ。统计分析结果表明，Ａ、Ｂ间Ｐ值为２．４１８Ｅ－０３，Ｂ、Ｃ间Ｐ 值为 ２．７４Ｅ－０２，Ａ、Ｃ间Ｐ值为１．１４Ｅ－０６，Ｄ、Ｅ间Ｐ值为１．２５Ｅ－０２，Ｅ、Ｆ间Ｐ值为４．０６Ｅ－０２，Ｄ、Ｆ间Ｐ值为２．７４Ｅ－０５，这两组内３个样本间根毛长度的差异都是显著的，从而证明了所建立的根毛长度测量体系可以用于根毛长度的量化分析，能快速准确地检测出各水稻品种间根毛长度的差异。
３ 小结与讨论
根毛的长度决定了根和根际接触的面积大小，进而对根吸收水分和营养有重大的影响。关于根毛初始和伸长的基因已经有相关的报道，在水稻中ＯｓＣＳＬＤ１、ＯｓＡＰＹ、ＲＨＬ１参与根毛的伸长。根毛的初始和伸长都需要细胞壁松弛蛋白ＥＸＰｓ。ＥＸＰ有两个亚家族ＥＸＰＡ和ＥＸＰＢ，有很多ＥＸＰＡ和ＥＸＰＢ成员已经证实在细胞壁松弛和快速扩张中起重要的作用［５－１０］。随着相关基因的分离，为进一步研究水稻根毛发育的分子机制奠定了基础。
由于根毛是根成熟区表皮细胞的细长突起，很容易受到损坏。水稻植株较大，根毛密集，所以对水稻根毛长度的测量有一定的难度。试验采用在培养皿中生长的水稻幼苗作为根毛测量的对象，不仅容易控制而且结果稳定可靠。虽然以前也有研究测量过根毛的长度，但都是取根的特定部分的若干根毛，测量其长度作为根毛的长度［１０］，其测量的长度有时不能代表整个根的根毛长度。而该研究采用软件统计的方法建立了一个新的水稻根毛长度的测量方法，用所选区域根毛长度的平均值来衡量整体根毛的长度，使得到的数据更有说服力。创建的基于Ｉｍａｇｅ Ｊ软件的水稻根毛长度测量方法，使对水稻根毛长度的精确量化分析成为可能，将有助于水稻根毛发育相关基因的发现及其功能研究，进一步推动水稻水分、养分吸收研究的发展。
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