吕红英
（吉林农业科技学院生物工程分院，吉林 吉林 １３２１０１）
摘要：通过单因素试验和正交试验，确定美味牛肝菌（Ｂｏｌｅｔｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）菌丝体液态发酵的优化条件，利用其发酵液研制出美味牛肝菌液态菌醋。结果表明，美味牛肝菌液态发酵的最佳培养基为： 葡萄糖２０．０ ｇ、酵母浸出膏５．０ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．５ ｇ、ＶＢ１ ０．０１ ｍｇ；最佳发酵条件为：ｐＨ ５．０、装液量９０ ｍＬ、培养温度２６ ℃、振荡速度１８０ ｒ／ｍｉｎ、培养时间６ ｄ。美味牛肝菌液态菌醋的最优配方为：发酵液５０％、柠檬酸０．２０％、稳定剂０．１８％、甜味剂０．１５％。
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关键词 ：美味牛肝菌（Ｂｏｌｅｔｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）；液态发酵；醋
中图分类号：Ｓ６４６．３；ＴＳ２６４．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）１６－４０２６－０５
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１６．０５０
收稿日期：２０１５－０５－１４
基金项目：重点学科培育项目［吉农院合字（２０１３）第００８号］
作者简介：吕红英（１９７６－），女，吉林桦甸人，讲师，硕士，主要从事食品生物技术及微生物发酵的研究，（电话）１３８０４４２９５５９（电子信箱）ｙｉｎｇ９１３＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ。
酿造醋不仅含有丰富的营养成分还具有天然、营养、保健等特性［１］。中国民间也流传着许多以食醋为主或为辅治疗疾病的药方［２］。食醋不仅有抗菌、缓解疲劳、降血脂、降低血清中的胆固醇含量、预防和治疗糖尿病等功效，而且还有抗氧化、抗衰老、美容、解酒保肝等作用［３，４］。
食用菌是能够形成大型肉质或胶质的子实体或菌核类组织，并能供人们食用或药用的一类大型真菌［５］，不仅味道鲜美，营养丰富，而且富含蛋白质、脂肪、多糖、维生素、抗生素、核苷酸等物质，能调节人体新陈代谢，增强体质，被誉为“人类植物性食品营养的顶峰”［６］，是深受大众喜爱的健康食品。为了丰富食品种类，提高食品营养价值和保健功能，可以将食用菌应用到食品工业中，其中食用菌发酵菌醋就是一种有效的途径。美味牛肝菌（Ｂｏｌｅｔｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）又名大脚菇，属于担子菌亚门层菌纲伞菌目牛肝菌科中的一种［７］，是一种世界范围内分布的食药兼用经济价值较高的真菌，中国各省均有分布，尤其西南地区产量较高［８］，且全世界已知的牛肝菌属已有１ ０２４种，中国已知的可食用的就有１９９种［９］。美味牛肝菌的肉质肥厚而细嫩、香味浓郁、味道鲜美、营养丰富、风味独特，美味牛肝菌含有多种生物碱可治腰腿疼痛、手足麻木、盘骨不舒、四肢抽搐以及妇女白带异常等症［９，１０］，具有一定的营养价值和药用价值。经常食用牛肝菌可明显增强机体免疫力、改善机体微循环。本试验旨在利用美味牛肝菌的营养功效研发液态发酵菌醋的生产工艺，拓宽其利用范畴。
１ 材料与方法
１．１ 材料
菌种：美味牛肝菌，酿酒干酵母，醋酸菌。
仪器：电子天平、真空抽滤装置、恒温摇床、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、手持糖量计等。
１．２ 工艺流程
１．３ 方法
１．３．１ 菌种活化 将美味牛肝菌种用接种针接到斜面培养基中，于２５ ℃活化培养５ ｄ，待菌丝体长满斜面［５］，备用。
１．３．２ 液体种子培养 将活化的美味牛肝菌用接种针从斜面接入到液体种子培养基中，培养温度２８ ℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养３ ｄ。
１．３．３ 液体发酵培养 将种子培养液按１０％接种量接种于发酵培养基，２８ ℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ ｄ后得到发酵液。
１．３．４ 菌丝体生物量测重方法 用双层纱布过滤即分离得到菌丝体和发酵液，发酵液备用，将菌丝体用去离子水冲洗３次再用滤纸吸至不滴水，用电子天平称重。
１．３．５ 补料 向上述美味牛肝菌发酵液中补充已灭菌的２０％蔗糖溶液，将其可溶性固形物含量调整为９％～１０％。
１．３．６ 酒精发酵、醋酸发酵 将补料后的美味牛肝菌发酵液１００ ｍＬ装入２５０ ｍＬ三角瓶中，接入预先活化好的酵母菌，接种量１０％，均匀搅拌，置于３０ ℃恒温培养箱中培养３～４ ｄ，待酒精含量达到５％～６％时停止酒精发酵。向酒精发酵后的成熟的酒醪中接入醋酸菌培养液，在２８～３２ ℃下进行醋酸发酵，醋酸发酵过程中每日搅拌２～３次，并随时检测发酵液中醋酸和酒精的含量变化。当酸度不再增加，酒精含量达到最小即到达醋酸发酵终点。
１．３．７ 加盐淋醋、澄清过滤 醋醅成熟后及时加入８％～１０％食盐抑制醋酸菌的活性，防止成熟醋醅发生过度氧化，降低醋酸产量。先将一半食盐放入醋醅上拌匀，另一半食盐撒在醋醅表面，第二天翻醅1次，接着再翻醅，１～２ ｄ即可进行淋醋，采用套淋法循环泡淋。然后将上述发酵液用4层纱布进行粗滤之后加入壳聚糖澄清，用真空泵进行抽滤， 即得澄清透明的美味牛肝菌醋原液。
１．３．８ 调配 量取饮用水和蜂蜜（作为风味成分，添加量４％，添加过多会增加成品饮料中糖的含量），然后对发酵液量、调味剂、稳定剂、柠檬酸等进行单因素试验，确定单因素对产品品质的影响，然后进行正交试验，以期获得最佳配方工艺［１1－１４］。
１．３．９ 装瓶、灭菌、陈酿、成品检验 定量装瓶封盖，装瓶后，立即用巴氏消毒法进行灭菌，密封陈酿２０～３０ ｄ左右，即得成品美味牛肝菌保健醋。对产品进行感官检验［１５］、理化检验、微生物检验，各项指标都符合饮料行业相关标准即为成品。
２ 结果与分析
２．１ 发酵培养基的筛选
２．１．１ 碳源对菌丝生长的影响 以蛋白胨２．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．５ ｇ，ＶＢ１ ０．０１ ｍｇ为单因子基础培养基［１６］，分别以２０．０ ｇ的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇和可溶性淀粉作碳源试验，以基础培养基为空白对照，确定对美味牛肝菌菌丝生长影响的最优碳源。图１结果表明，美味牛肝菌对试验中所用碳源均可利用，既能利用成分复杂的复合碳源，也能利用单糖和双糖等小分子碳源，所试碳源中以葡萄糖最好，菌丝体生物量达１２１ ｇ／Ｌ，菌丝生长快，菌丝球小，均匀，密度高。所以综合不同碳源对美味牛肝菌菌丝生长的影响，以葡萄糖为最适碳源。
２．１．２ 氮源对菌丝生长的影响 以葡萄糖２０．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．５ ｇ，ＶＢ１ ０．０１ ｍｇ为基础培养基，分别以５．０ ｇ的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出膏、硫酸镁、麸皮和水解乳蛋白作氮源试验，以基础培养基为空白对照，测定不同氮源对美味牛肝菌菌丝生长的影响。图２结果表明，在不同的氮源培养基中菌丝体生物量有所不同。其中以酵母浸出膏作为氮源时，菌丝生物量最高，并且菌丝球大小均匀。所以综合不同氮源对美味牛肝菌菌丝生长的影响，以酵母浸出膏为最适氮源。
根据上述试验结果表明，确定最适发酵培养基组成为：葡萄糖２０．０ ｇ，酵母浸出膏５．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １．５ ｇ，ＶＢ１ ０．０１ ｍｇ。
２．２ 发酵条件的选择
２．２．１ 培养温度对菌丝生长的影响 将接种摇瓶分别置于１８、２２、２６、３０ ℃ １８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ ｄ后，测定培养温度对美味牛肝菌丝生长的影响（表１）。结果表明，温度对美味牛肝菌的生长十分重要，在受试的１８～３０ ℃菌丝均能生长。但是在较低温度和较高温度下菌丝生长都不是很好，只有在２６ ℃菌丝最好，菌丝体生物量高，且合适的温度能缩短发酵时间。因此，菌丝生长的最适培养温度为２６ ℃。
２．２．２ 培养时间对菌丝生长的影响 ２５０ ｍＬ三角瓶装入９０ ｍＬ培养液，２６ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养，测定不同培养时间对美味牛肝菌丝生长的影响（表２）。由表２可知，随着发酵时间的延长，菌丝体含量逐渐增加，但发酵前期菌丝体生物量增加迅速，第五天出现了大量菌丝球，发酵液变得透明，第六天菌丝体生物量达到较大值。从第七天再继续培养，虽然菌丝体也在增加，但菌丝体生物量增加幅度相对缓慢。而随着发酵周期的延长，生产成本增加幅度较大，因此，综合产品质量因素及经济因素，菌丝生长的最适发酵周期确定为６ ｄ。
２．２．３ ｐＨ对菌丝体生长的影响 将培养液ｐＨ分别调为４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０，接斜面菌种１．０ ｃｍ２、２６ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ ｄ后，测定ｐＨ对美味牛肝菌丝生长的影响（表３）。由表３可知，美味牛肝菌在偏酸的环境下生长较好，菌丝体生物量比较高，且该ｐＨ与培养基的自然ｐＨ ５．０相近。综合培养基初始ｐＨ对菌丝生长的影响，美味牛肝菌丝生长的最适ｐＨ为５．０～５．５。
２．２．４ 振荡速度对菌丝生长的影响 ２５０ ｍＬ三角瓶于２６ ℃条件下分别处于９０、１２０、１５０、１８０、２１０ ｒ／ｍｉｎ振荡速度培养６ ｄ后，测定振荡速度对美味牛肝菌丝生长的影响（表４）。由表４可知，食用菌液体摇瓶培养的菌丝生物量显著优于固体培养基或液体静置培养基，在一定范围内，随着转速的增大，通气量增大，菌丝球数量增多，有利于菌丝的生长；在转速达到１８０ ｒ／ｍｉｎ时菌丝生物量最大，但当转速达到２１０ ｒ／ｍｉｎ时，菌丝生长开始下降，因此，美味牛肝菌丝生长的最适振荡速度为１８０ ｒ／ｍｉｎ。
２．２．５ 装液量对菌丝生长的影响 ２５０ ｍＬ的三角瓶中分别选择５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０ ｍＬ装液量，２６ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养６ ｄ后，测定装液量对美味牛肝菌丝生长的影响（表５）。由表５可知，菌丝体生物量与装液量呈正相关，随着装液量的增加，菌丝体生物量也增多；装液量少，菌丝体生物量也少，培养基利用率也不高，但装液量超过９０ ｍＬ时，由于摇瓶供氧不足，菌丝生物量的增加幅度降低。因此，美味牛肝菌丝生长的最适装液量确定为９０ ｍＬ。
２．3 发酵条件综合试验
通过发酵过程中培养基ｐＨ、振荡速度、培养温度、装液量及培养时间５个因素，设计３个水平进行试验， 以菌丝体干重为参考指标，确定最优发酵条件（表６）。由表６的极差Ｒ的大小可知，Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ＞Ｅ即各因子重要性的顺序为：ｐＨ＞装液量＞培养温度＞转速＞培养时间，发酵的最优搭配组合为Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ３Ｅ２，即ｐＨ ５．０、装液量９０ ｍＬ、培养温度２６ ℃、振荡速度１８０ ｒ／ｍｉｎ、培养时间６ ｄ来进行发酵试验，有利于美味牛肝菌在发酵罐中产生大量的菌丝体，且发酵液香味清纯。
２．4 菌醋配方的设计
２．4．１ 发酵液对产品品质的影响 采用柠檬酸的添加量为０．２％、稳定剂（黄原胶）的添加量为０．２％、甜味剂（甜菊糖苷）的添加量为０．０５％～０．１５％的基础上分别加入３０％、４０％、５０％、６０％、７０％的发酵液配制饮料（表７）。由表７可知，当发酵液的添加量从３０％增加到５０％时，产品品质越来越好。当发酵液的添加量继续增加，发酵液对发酵饮料的品质影响较小，甚至停止。
２．4．２ 甜味剂的选用及用量 甜菊糖苷作为一种常用的甜味剂，其用量直接影响着发酵饮料的风味，需要严格控制用量，是调配过程中应特别注意的步骤。在发酵液的添加量为５０％，柠檬酸的添加量为０．２％，稳定剂（黄原胶）的添加量为０．２％的基础上分别加入０．０１％、０．０５％、０．１０％、０．１５％、０．２０％、０．２５％的甜菊糖苷配制饮料。由表８可知，甜菊糖苷的添加量在０．０５％～０．１５％时品质较好，比较合适大众口味。
２．4．３ 柠檬酸对产品品质的影响 在发酵液的添加量为５０％，稳定剂（黄原胶）的添加量为０．２％，甜味剂（甜菊糖苷）的添加量为０．０５％～０．１５％的基础上分别加入０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％的柠檬酸配制饮料。由表９可知，当柠檬酸的添加量为０．２％时发酵饮料的感官品质最好，当其量超过０．２％后，发酵饮料的酸味越来越大，从而影响产品品质。
２．4．４ 稳定剂的选择 通过前期试验对黄原胶、果胶、明胶、ＣＭＣ等稳定剂进行对比选择试验后，确定黄原胶稳定效果最好，需对黄原胶的用量进一步确定。在发酵液的添加量为５０％，柠檬酸的添加量为０．２％，甜味剂（甜菊糖苷）的添加量为０．０５％～０．１５％的基础上分别加入０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％的稳定剂（黄原胶）配制饮料。由表１０可知，当稳定剂的添加量达到０．２％时，发酵饮料的感官品质最好，且不会出现沉淀，而超过０．２％后稳定剂会使发酵饮料中的可溶性固形物产生沉淀，从而影响感官品质。
２．5 发酵饮料配方的综合试验
在单因素试验的基础上，选取最优的３个水平，按Ｌ９（３４）正交试验设计最佳配方。正交试验因素水平见表１１，试验结果见表１２。由表１２可知，Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，即发酵液对发酵饮料品质的影响显著，柠檬酸、稳定剂、甜味剂对发酵饮料品质的影响均不显著，因素影响主次顺序为发酵液＞稳定剂＞柠檬酸＞甜味剂，试验时可选取最佳水平为Ａ２Ｂ３Ｃ２Ｄ２，即发酵液５０％、柠檬酸０．２０％、稳定剂０．１８％、甜味剂０．１５％时，感官评分最高，发酵饮料品质最好。
３ 结论
以美味牛肝菌为研究对象，从菌种的活化、培养、发酵及发酵饮料配方的设计等方面进行研究。先对发酵培养基的筛选进行单因素试验，得出最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母浸出膏，然后对发酵条件的选择进行正交试验，得出最佳发酵条件为：ｐＨ ５．０、装液量９０ ｍＬ、培养温度２６ ℃、振荡速度１８０ ｒ／ｍｉｎ、培养时间６ ｄ，最后进行发酵饮料配方的正交试验得到发酵饮料的最优配方为：发酵液５０％、柠檬酸０．２０％、稳定剂０．１８％、甜味剂０．１５％。试验采用食用菌液态发酵的方法，制得更加优化的发酵液，并对其发酵液进行食品开发，经后期调配降低酸度，并添加甜味物质制成的美味牛肝菌保健醋饮料，风味独特， 酸甜可口， 富含多种生物活性物质， 具有十分广阔的市场前景。
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