王巧燕，李丽丽，徐存拴
（河南师范大学生命科学学院／河南省-科技部共建细胞分化调控国家重点实验室培育基地，河南 新乡 ４５３００７）
摘要：为研究ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α组合对原代大鼠肝细胞体外增殖的作用，构建了ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α基因的慢病毒载体，共转染体外培养的原代大鼠肝细胞；倒置荧光显微镜下观察转染细胞是否增殖；反转录ＰＣＲ （Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ） 检测外源基因和肝细胞特异基因的表达情况；ＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－ｓｃｈｉｆｆ）染色和吲哚菁绿（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｇｒｅｅｎ，ＩＣＧ）摄取检测转染细胞功能。结果表明，慢病毒转染４ ｄ后表达绿色荧光蛋白的部分肝细胞呈现上皮样形态并增殖成簇，与正常培养的肝细胞相比增殖能力明显增强；ＰＣＲ分析表明增殖的肝细胞除表达外源ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α外，还表达肝细胞的标志基因Ａｌｂ、ＣＫ１８和Ｇ６ｐ；功能检测结果表明增殖的肝细胞具有成熟肝细胞糖原合成和吲哚菁绿摄取的能力。以上结果表明，ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α能促使体外培养的原代大鼠肝细胞进行增殖，并维持肝细胞的基本生物学特性。
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关键词 ：ＦｏｘＡ３；Ｈｎｆ４α；大鼠肝细胞；细胞增殖
中图分类号：Ｑ２５３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）０７－１６４８－０４
ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．０７．０３０
肝细胞占总肝量的７０％～８０％，具有合成血清蛋白、酶和辅酶因子，储存糖原和维生素，以及参与药物和外源物质代谢等功能，是肝脏生理功能的主要执行者［１］。在体外，肝细胞可广泛应用于基础研究、药物研发、生物人工肝及细胞治疗的研究与临床中［２］。因此对功能完善的肝细胞有较高的需求，尽管原代肝细胞具有较完整的肝细胞功能，但体外培养中难以增殖和长期维持肝细胞的功能［３］。提高肝细胞体外增殖能力是解决肝细胞来源匮乏的一个重要方向，目前实现肝细胞体外增殖的策略有：①在培养基中添加生长因子、激素或化学物质［３－５］；②使用特殊的基质或者肝细胞和其他细胞共培养［６－９］； ③肝细胞转染外源基因实现永生化［１０］。前两种策略能较好地维持肝细胞的特异基因表达和功能，但细胞体外增殖能力有限；肝细胞永生化能使体外培养的肝细胞获得无限增殖的能力，主要策略有猴肾病毒４０大Ｔ抗原（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ，ＳＶ４０Ｔ）［１１］和端粒酶逆转录酶（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＴＥＲＴ）［１２］基因介导的永生化。
２０１１年Ｓｅｋｉｙａ等［１３］将肝细胞核因子组合Ｆｏｘａ３和Ｈｎｆ４α导入小鼠成纤维细胞中，获得具有体外增殖能力的肝样细胞，这表明ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α可能对肝细胞体外增殖有促进作用。因此本研究旨在探讨ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α是否能促进体外培养的原代大鼠肝细胞增殖，以期建立一种基于肝细胞特异基因作用的永生化肝细胞系，为肝细胞永生化提供新思路。
１ 材料与方法
１．１ 细胞株、试验动物和主要试剂
人ＨＥＫ２９３Ｔ细胞、ＨＥＫ２９３细胞、慢病毒载体ｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰ（以下简称ｐＣＤＨ） 质粒、包装质粒ｐＣＭＶΔ８．９１和ｐＶＳＶ－Ｇ均为本实验室保存；ｐＵＣ５７－ＦｏｘＡ３和ｐＵＣ５７－Ｈｎｆ４α质粒及所有引物均合成于生工生物工程有限公司；ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、质粒小量提取试剂盒ＴａＫａＲａ ＭｉｎｉＢＥＳＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＤＮＡ切胶回收试剂盒ＴａＫａＲａ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．０、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ均购自宝生物工程（大连）有限公司；ＥＧＴＡ、ＣａＣｌ２、ＢＥＳ、Ｔｒｉｚｏｌ均购自上海鼎国生物工程有限公司；Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠由河南师范大学动物中心提供，原代大鼠肝细胞从ＳＤ大鼠肝脏中分离；胶原酶、肝细胞培养添加剂Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｓｅｌｅｎｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＴＳ－Ｇ）１００×、ＤＭＥＭ（高糖）培养基和胎牛血清均购自Ｇｉｂｃｏ公司；血液／细胞／组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒购自ＴＩＡＮＧＥＮ公司；Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；糖原ＰＡＳ过碘酸雪夫染色试剂盒和吲哚菁绿分别购自森贝伽公司和ａｌａｄｄｉｎ公司。
１．２ 载体构建与鉴定
根据大鼠ＦｏｘＡ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４０２６９１９９５），-Ｈｎｆ４α（Ｇｅｎｅ ＩＤ：４００１５３９８５，ＮＭ ０２２１８０．２）基因序列，使用Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０设计包含ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点（加粗）的ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α引物。引物序列为：ＦｏｘＡ３上游引物：５′－ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＡＧＴＧ－３′；ＦｏｘＡ３下游引物：５′－ＧＧＣＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＴＡＡＣ－３′；Ｈｎｆ４α上游引物：５′－ＴＧＣＴＣＴＡ－ＧＡＡＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣ－３′；Ｈｎｆ４α下游引物：５′－ＧＧＣＣＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣＴＡＣＣＧＡＡＧＧ－３′。分别以ｐＵＣ５７－ＦｏｘＡ３和ｐＵＣ５７－Ｈｎｆ４α为模板，ＰＣＲ扩增ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α，ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切ＰＣＲ产物，酶切后的目的片段分别插入ｐＣＤＨ质粒中，连接产物转入ＤＨ５α感受态大肠杆菌，对长出的克隆进行双酶切鉴定。
１．３ 细胞培养
人ＨＥＫ２９３细胞和ＨＥＫ２９３Ｔ细胞培养在ＤＭＥＭ高糖培养基中，内含１０％ 胎牛血清、１００ Ｕ／ｍＬ青霉素、１００ μｇ／ｍＬ链霉素，置于５％ ＣＯ２、３７°Ｃ培养箱中培养，在细胞生长至８０％～９０％ 汇合度时进行传代。大鼠原代肝细胞培养在含１０％ 胎牛血清、１％ ＩＴＳ－Ｇ和１％ 青链霉素的ＤＭＥＭ培养基，置于５％ ＣＯ２、３７ °Ｃ培养箱中培养，每天换液。
１．４ 重组慢病毒包装、浓缩及滴度测定
采用磷酸钙转染法包装病毒：转染前１ ｄ接种１×１０６个２９３Ｔ细胞于７５ ｃｍ２的培养瓶中培养，待细胞汇合度达５０％～６０％时进行转染。取２０ μｇ目的质粒（ｐＣＤＨ－ＦｏｘＡ３或ｐＣＤＨ－Ｈｎｆ４α）和１０ μｇ ｐＣＭＶΔ８．９１、１０ μｇ ｐＶＳＶ－Ｇ用无菌双蒸水调至４５０ μＬ，加入５０ μＬ的２．５ ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，混匀后加入５００ μＬ的２×ＢＥＳ缓冲盐溶液充分混匀，室温放置２０ ｍｉｎ后缓慢加到培养２９３Ｔ细胞的培养瓶中。１４～１６ ｈ后换液，４８和７２ ｈ后收集含病毒的上清液，０．４５ μｍ滤膜过滤，４ ℃、６ ０００ ｒ／ｍｉｎ低速离心１６ ｈ，得到浓缩的病毒颗粒［１４］，分装后－８０ °Ｃ保存。病毒液按照１０倍倍比稀释后感染２９３细胞，２ ｄ后观察荧光表达情况，细胞计数计算病毒滴度。
１．５ 原代大鼠肝细胞的分离、培养及感染
采用Ｓｅｇｌｅｎ等［１５］的两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞：①门静脉灌注含ＥＧＴＡ的Ｄ－Ｈａｎｋｓ液；②换用含０．０５％胶原酶Ⅳ的Ｈａｎｋｓ液灌注。制成细胞悬液，台盼蓝排斥试验测定细胞存活率并计数，调整细胞密度接种于铺有鼠尾胶原的６孔板中培养，４ ｈ后换液去除没有贴壁的细胞和死细胞，继续培养１２～１６ ｈ用于转染。稀释ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α病毒液，以１０ ＭＯＩ （ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）的病毒数量加入同一个肝细胞培养孔中，６～１２ ｈ后换液以去除病毒液。培养４８ ｈ后荧光显微镜下观察荧光表达率、细胞形态和增殖情况。肝细胞感染病毒后每３ ｄ换液1次。
１．６ ＰＣＲ检测
大鼠肝细胞感染慢病毒７ ｄ后，按照ＴＩＡＮＧＥＮ的基因组提取说明书提取感染细胞和正常大鼠肝细胞的基因组，ＰＣＲ扩增ｅｘｏ ＦｏｘＡ３和ｅｘｏ Ｈｎｆ４α；采用Ｔｒｉｚｏｌ法抽提感染细胞和正常大鼠肝细胞的总ＲＮＡ，逆转录合成ｃＤＮＡ，以其为模板进行ＰＣＲ扩增，以３－磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）基因作为内参检测肝细胞特异基因Ａｌｂ、ＣＫ１８和Ｇ６ｐ的表达情况。PCR反应条件：９４ °Ｃ预变性３ ｍｉｎ； ９４ °Ｃ变性３０ ｓ，退火（温度见表１）４５ ｓ，７２ °Ｃ延伸４５ ｓ，35个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后经１％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相并观察。ＰＣＲ引物见表１。
１．７ ＰＡＳ反应检测
大鼠肝细胞感染慢病毒１４ ｄ后，取感染肝细胞进行细胞涂片，４％多聚甲醛固定１０ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗；过碘酸水溶液作用１０ ｍｉｎ，水洗；Ｓｃｈｉｆｆ试剂避光反应１０ ｍｉｎ，水洗；苏木素染色１～２ ｍｉｎ，水洗；分化液分化１～２ ｍｉｎ，水洗后倒置相差显微镜下观察并照相。
１．８ ＩＣＧ摄取检测
大鼠肝细胞感染慢病毒１４ ｄ后，取感染肝细胞吸弃培养基，加入含１ ｍｇ／ｍＬ ＩＣＧ的肝细胞培养基，３７ °Ｃ培养箱中孵育１ ｈ，ＰＢＳ洗３次，加入肝细胞培养基，倒置相差显微镜下观察细胞颜色并照相，摄取ＩＣＧ的细胞呈现绿色。
２ 结果与分析
２．１ 重组慢病毒载体的鉴定和滴度测定
构建的重组慢病毒载体ｐＣＤＨ－ＦｏｘＡ３和ｐＣＤＨ－Ｈｎｆ４α经ＸｂａⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后分别获得１ ０６５ ｂｐ（ＦｏｘＡ３）和１ ３９８ ｂｐ（Ｈｎｆ４α）的片段（图１），与预期结果相符，表明构建的重组慢病毒载体是正确的。经计算浓缩后的ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α慢病毒滴度分别为６×１０７ ＴＵ／ｍＬ和７．５×１０７ ＴＵ／ｍＬ。
２．２ 重组慢病毒感染肝细胞
在含ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α基因的慢病毒感染原代肝细胞４ ｄ后，观察到表达绿色荧光蛋白的细胞中有些增殖成簇，有些迅速凋亡。与原代肝细胞相比，增殖细胞形态呈多角的上皮样、体积变小，有较强的增殖能力。增殖的肝细胞在长期体外培养中维持稳定的形态和较高的增殖速率（图２）。
２．３ 增殖肝细胞的ＰＣＲ检测
检测增殖肝细胞中外源基因的表达情况：分别以增殖肝细胞的基因组和ｍＲＮＡ作为模板，以质粒作为阳性对照进行ＰＣＲ扩增，结果表明外源基因ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α整合到增殖肝细胞的基因组中，并能正确表达（图３Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲ检测增殖细胞的肝细胞标志基因的表达情况，结果显示增殖的肝细胞表达肝细胞标志基因Ａｌｂ、ＣＫ１８和Ｇ６ｐ，ＧＡＰＤＨ为内参（图３Ｂ）。
２．４ 增殖肝细胞功能检测
ＰＡＳ染色后显微镜下可见增殖肝细胞呈紫红色阳性反应，同时ＩＣＧ摄取试验表明增殖肝细胞有摄取ＩＣＧ的能力（图４）。
３ 讨论
目前生物人工肝和肝细胞移植作为原位肝移植的替代方案，在肝脏疾病临床治疗中取得了一定的效果。肝细胞体外难以增殖且部分功能会逐渐丧失，在数量和质量上远不能满足临床需要，因此研究肝细胞体外增殖有着十分重要的现实意义。ＦｏｘＡ３是起始肝脏发育的“先锋因子”、能调节肝特异基因表达和维持血糖平衡［１６－１８］；Ｈｎｆ４α参与哺乳动物肝脏发育过程中肝细胞的分化和形态形成，而且对于成体肝脏的代谢调节和功能维持是必需的［１９，２０］。研究表明ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α还能调控终末分化细胞向肝样细胞的转分化，Ｆｏｘａ１＋Ｈｎｆ４α、Ｆｏｘａ２＋Ｈｎｆ４α、Ｆｏｘａ３＋Ｈｎｆ４α、Ｇａｔａ４＋Ｈｎｆ１α＋Ｆｏｘａ３组合均能使小鼠成纤维细胞转分化为肝样细胞［１３，２１］；ＦＯＸＡ３ ＋ＨＮＦ１Ａ＋ＨＮＦ４Ａ组合还能诱导人成纤维细胞转分化为肝样细胞［２２］。然而ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α对肝细胞体外增殖的作用研究还未见报道。因此本研究通过构建ｐＣＤＨ－ＦｏｘＡ３和ｐＣＤＨ－Ｈｎｆ４α重组慢病毒载体并共转染体外培养的原代大鼠肝细胞，从而探究ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α组合对原代大鼠肝细胞体外增殖的作用。
结果表明，肝细胞感染ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α慢病毒后增殖能力明显增强，外源基因ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α整合到增殖的肝细胞基因组中并表达，外源基因没有被沉默，这与Ｓｅｋｉｙａ等［１３］的研究结果一致。ＲＴ－ＰＣＲ结果还显示增殖的肝细胞表达肝细胞特异基因Ａｌｂ、ＣＫ１８、Ｇ６ｐ。ＰＡＳ染色和ＩＣＧ摄取结果表明增殖肝细胞维持了肝细胞糖原合成和吲哚菁绿摄取的功能。以上结果证实了ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α对原代大鼠肝细胞体外增殖的促进效应，并且维持肝细胞的基本生物学特征。为进一步研究肝细胞增殖的调控机制提供了试验基础，也为肝细胞永生化提供了新思路。与其他来源的肝样细胞相比，本试验获得的增殖肝细胞也许能避免表观遗传记忆。而ＦｏｘＡ３和Ｈｎｆ４α促进肝细胞体外增殖的机制还需要进一步研究。
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［２０］ ＫＬＯＣＫＥ Ｒ， ＪＯＳ?魪ＧＭＥＺ－ＬＥＣＨ?魷Ｎ Ｍ， ＥＨＲＨＡＲＤＴ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｏｒｔａｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｌｉｎｅｓ ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２００２， ２９４（４）： ８６４－８７１．
［２１］ ＨＵＡＮＧ Ｐ， ＨＥ Ｚ， ＪＩ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ， ２０１１， ４７５（７３５６）： ３８６－３８９．
［２２］ ＨＵＡＮＧ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ＧＡＯ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ［Ｊ］． Ｃｅｌｌ Sｔｅｍ Cｅｌｌ， ２０１４， １４（３）： ３７０－３８４．