罗 彭，任赛赛，梁 宁，陈 攀，廖彭莹，潘为高
（广西中医药大学，南宁 ５３０００１）
摘要： 为研究枇杷［Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｌｉｎｄｌ．］果的动物体内利尿作用，获得利尿活性物质部位和活性单体，阐述枇杷果利尿作用的物质基础，为开发和研制枇杷果植物药利尿剂奠定基础，通过试剂法提取、系统溶剂萃取制备枇杷果各极性物质部位。依据生物活性跟踪法，以小鼠体内利尿为活性指标，柱色谱等为分离纯化方法，筛选出利尿物质部位，并进一步追踪利尿单体。追踪过程中通过先小量摸索、后大量分离制备的策略，解决体内给药剂量过大的问题。通过波谱法鉴定单体结构。结果表明，枇杷果乙醇提取物的乙酸乙酯萃取段有较显著的体内利尿活性（Ｐ＜０．０５），利尿强度接近氢氯噻嗪而稍弱于呋噻米，利尿作用速度较缓和。从乙酸乙酯萃取段中分离纯化获得一个利尿活性物质，经鉴定为熊果酸，利尿作用显著（Ｐ＜０．０５），利尿强度接近氢氯噻嗪而稍弱于呋噻米，利尿作用速度较缓和。枇杷果药食两用，其乙酸乙酯萃取段可有望开发为长期使用的安全天然利尿药物。熊果酸是枇杷果利尿作用的物质基础，其含量可作为该药材利尿用途方面的质量控制指标。该研究是直接通过动物体内药理指标筛选活性单体成功的不多案例之一，具有方法学借鉴价值。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ：枇杷［Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｌｉｎｄｌ．］果；乙酸乙酯部位；熊果酸；利尿；体内；生物活性跟踪法
中图分类号：Ｓ６６７．３；Ｒ９３１．６ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）16－3986-04
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.039
收稿日期：2015-05-28
基金项目：广西壮族自治区教育厅科研项目（２０１３ＹＢ１２５）；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划资助项目［桂教人（２０１４）７号］；广西高校重点实验室资助项目［桂教科研（２０１４）６号］
作者简介：罗 彭（１９８２－），女，湖北潜江人，讲师，硕士，主要从事民族药活性成分研究，（电话）１５９０７７１５１５０（电子信箱）ｌｃｌ４０２６１４６１＠１６３．ｃｏｍ；通信作者，潘为高（１９７７－），男（瑶族），广西兴安人，教授，博士，主要从事天然药物活性成分研究，（电话）１５９９４３５１０９４（电子信箱）ａｇａｏ８１７０６６７２＠１６３．ｃｏｍ。
枇杷（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｌｉｎｄｌ．）为蔷薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）枇杷属植物，原产于中国，是中国南方特产的常绿果树，主要分布于中国南部及陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、四川、贵州、云南等地［１］。枇杷已在中国、日本、印度、西班牙、巴西、美国、澳大利亚、南非等世界各国进行商业化规模种植［２］。中国是世界上最主要的枇杷生产国，栽培面积和产量占世界的７０％以上［３］。
枇杷果实除鲜食外，果肉可生产枇杷酒、罐头、饮料、糖浆剂等，有润肺、止咳、生津的功效［３］。据报道，枇杷（包括果、叶）的苦杏仁苷有镇咳平喘作用［４］，其中的三萜化合物有抗炎抗免疫作用［５］，另外枇杷还有降血糖、抗癌、抗氧化、保肝等作用［１，６］。但现代研究中并无任何关于枇杷利尿作用的报道。
枇杷果在中国传统中药记载中，有润肺止咳（果肉）、消除水肿（果核）等功效［７］，而消除水肿与利尿有密切关系。笔者前期发现给动物喂食枇杷果肉也具有良好的利尿作用。考虑到枇杷果核的潜在毒性作用，本研究只使用了其果肉进行利尿研究。一方面拟测定枇杷果利尿活性的作用强度，另一方面拟通过生物活性跟踪法，追踪分离枇杷果中利尿活性成分，探索枇杷果利尿作用的物质基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料与设备
药材：枇杷鲜果购自广西武鸣县，经广西中医药大学韦松基教授和朱意麟实验师作生药学鉴定。
对照药品：呋噻米（Ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）为江西亚邦爱普森药业有限公司产品，氢氯噻嗪（Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｔｈｉａｚｉｄｅ，ＨＣＴＺ）为山西云鹏制药有限公司产品。
动物：昆明种ＳＰＦ级小鼠，（２０±２） ｇ，由广西医科大学实验动物中心提供。
仪器设备：ＡＥ１００型 １/１０ ０００电子分析天平（日本岛津公司）；代谢笼；ＳａｒｔｏｒｉｕｓＢＰ１２１Ｓ型电子天平（精度０．１ ｍｇ）；Ｂｒｕｃｋ Ｄｒｘ－５００型核磁仪（Ｂｒｕｃｋｅｒ， Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ质谱仪（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）。
１．２ 试验方法
１．２．１ 体内利尿活性测定 参照Ａｂｄａｌａ等［８］的小鼠代谢笼法，并作适当修改：所有试验均在同一实验室中进行，小鼠饲养条件一致，１２ ｈ／１２ ｈ的光暗循环，室温控制在２４ ℃左右，实验室安静、通风。试验前３ ｄ置同一实验室观察饲养，自由摄食与饮水，各组饲料与饮用水完全相同。小鼠随机分组，每组１２只（雌雄各半），分别放入代谢笼中。每个测定阶段均设样品组、阳性对照组、阴性对照组。试验前禁食１２ ｈ（不禁水），试验时禁食禁水。轻压小鼠下腹排尽余尿，各组动物灌胃给予不同的药物，给药量为２０ ｍＬ／ｋｇ体重。空白对照组给予等量的蒸馏水；阳性对照组分别给予氢氯噻嗪和呋噻米（２５ ｍｇ／ｋｇ体重给药，生理盐水配制，浓度为１．２５ ｍｇ／ｍＬ）；试验组给予枇杷果不同活性物质部位（段），因枇杷果各有效成分的含量随分离阶段不同而不同，故按后续分离纯化阶段设定给药剂量。每日１次。记录给药时间。每小时用电子天平称量尿液收集器１次，连续观察记录７ ｈ，统计１ ｈ和７ ｈ总尿量。重复测量６次。
１．２．２ 生物活性跟踪 经查阅文献，尚无理想的体外利尿药理指标可用于生物活性跟踪，故本试验直接通过小鼠体内利尿药理作为筛选指标。该方法能直接证实药物的有效性（比体外指标更可靠），但直接进行动物体内试验，经口给药剂量大，虽然分离前期所得各样品量充足，但后期随着分离的不断进行，某些样品总量小，活性追踪无法进行。为克服这一困难，本试验在分离前期采取小批量药材摸索条件，全方位获得各物质部位及大柱各流份，进行活性筛选；在前期明确活性部位或流份的基础上，加大药材量，着重制备活性部位及流份，放弃其他物质部位及流份，以获得足够的样品量用于后期跟踪。
１．２．２．１ 小批量摸索阶段 利尿物质部位的筛选。枇杷果不同萃取部位的制备：枇杷去核果肉２．８ ｋｇ，于５０ ℃真空干燥后，用９５％乙醇渗漉提取至提取液近无色，负压浓缩后得乙醇提取物１２３．６ ｇ。乙醇提取物用１８０ ｍＬ蒸馏水悬浊，依次用２５０ ｍＬ石油醚（沸程６０～９０ ℃）、乙酸乙酯萃取，得到石油醚部位浸膏为５．０ ｇ（生药出膏率０．１８％），乙酸乙酯部位浸膏为９．６ ｇ（生药出膏率０．３４％），将剩余的含水溶液在真空中蒸发，得到残渣水部位浸膏为１０９．４ ｇ（生药出膏率３．９１％）。经乙醇渗漉后的药渣阴干，用水继续渗漉提取，回收溶剂后得水提物浸膏２２６．１ ｇ（生药出膏率８．０８％）。经口给药剂量为１０ ｇ／ｋｇ（生药／体重），故取石油醚部位浸膏０．０１８ ｇ，乙酸乙酯部位浸膏０．０３４ ｇ，残渣水部位浸膏０．０３９ ｇ，水提物浸膏０．０４５ ｇ，分别用０．５ ｇ饲料将其研匀加入２０ ｍＬ水溶解，制成混悬液。设定试验组及空白对照组，将上述浸膏用小鼠代谢笼法测定体内利尿活性，筛选出活性部位。结果表明乙酸乙酯萃取部位具有显著的利尿作用（Ｐ＜０．０１）（表１）。
利尿活性流份的筛选：取利尿活性部位乙酸乙酯段９．６ ｇ，经硅胶（２００ ｇ，２００～３００目）柱色谱分离，氯仿∶甲醇梯度洗脱（１００∶０→５０∶１→３０∶１→１０∶１→５∶１→２∶１→０∶１００）（Ｖ／Ｖ，下同），收集并检识合并流份后，分别得到５０∶１流份、３０∶１流份、１０∶１流份和５∶１流份（其他梯度洗脱所得物质量极少），各流份干燥后均用来做药理试验，灌胃体积为２０ ｍＬ／ｋｇ体重，灌胃量为２５ ｍｇ/ｋｇ体重。得到有效流分为３０∶１流份。
１．２．２．２ 大批量制备、分离阶段 枇杷去核果肉１００ ｋｇ，重复上述提取分离过程，得氯仿∶甲醇＝３０∶１高活性段（１１．０８ ｇ）。取上述样品经硅胶柱色谱（２００～３００目，柱直径１０ ｃｍ）分离，石油醚︰乙酸乙酯梯度洗脱（４∶１→２∶１→１∶１→０∶１００），收集并检识合并流份后，分别得到４∶１流份、２∶１流份和１∶１流份（其他梯度洗脱所得物质量极少），各流份干燥后均用做利尿作用筛选，灌胃剂量为２５ ｍｇ／ｋｇ体重。得到有效流份为石油醚∶乙酸乙酯（４∶１）洗脱出来的４∶１流份（０．５４ ｇ）。将上述有活性的４∶１流份经硅胶柱色谱（３００～４００目，柱直径２ ｃｍ）行石油醚︰乙酸乙酯（４∶１）等梯度洗脱，再经硅胶柱色谱（薄层硅胶，柱直径１ ｃｍ）行石油醚∶丙酮（６∶１）等梯度洗脱，获得含量较高的高纯单体成分（４１ ｍｇ），经药理检测为活性物质。
纯度检查：用３种不同的展开系统进行ＴＬＣ检识，碘蒸气显色，均呈黄色单斑，结果如下：系统一为石油醚∶乙酸乙酯（２∶１），Ｒｆ＝０．４９；系统二为石油醚∶丙酮（２∶１），Ｒｆ＝０．６０；系统三为氯仿∶甲醇（１０∶１），Ｒｆ＝０．８３。
１．２．３ 结构鉴定方法 通过光谱手段进行结构鉴定。ＥＩ－ＭＳ 在Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｔｒａｃｅ ＤＳＱ质谱仪上测定；１３Ｃ－ＮＭＲ、ＤＥＰＴ （１２５ＭＨｚ）和１Ｈ－ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ） 在Ｂｒｕｃｋ Ｄｒｘ－５００核磁仪上测定（温度３００ Ｋ，溶剂Ｃ５Ｄ５Ｎ，ＴＭＳ作内标）。
１．２．４ 统计方法 数据统计分析和作图采用软件ＳＰＳＳ１３．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ２００４ （ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ，ＵＳＡ）进行。统计数据均以平均值±标准差表示。各组与空白对照组的差异性通过Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓａｍｐｌｅｓ Ｔ－ｔｅｓｔ进行分析，以Ｐ＜０．０５认为具有显著性差异。
２ 结果与分析
利尿物质部位：由表１可见，用１ ｈ尿量、７ ｈ总尿量作为指标，与空白对照组相比，乙酸乙酯萃取部位具有良好的利尿作用（Ｐ＜０．０５）。从利尿指数看，乙酸乙酯部位利尿作用（１．３４７）稍弱于呋噻米（１．４１１），而接近氢氯噻嗪（１．３７０）。从利尿急缓度（１ ｈ尿量／７ ｈ尿量）看，与快速利尿药呋噻米（０．６６６）相比，乙酸乙酯部位利尿作用（０．４１５）具有缓释性特点，作用速度与氢氯噻嗪更相似（０．４７７）。
利尿流份、单体：由表１可见，用１ ｈ尿量、７ ｈ总尿量作为指标，与空白对照组相比，氯仿∶甲醇（３０∶１）洗脱流份、石油醚∶乙酸乙酯（４∶１）洗脱流份、活性单体有显著利尿作用（Ｐ＜０．０５），其他流份效果不显著。从利尿指数看，３０∶１流份（１．３４７）、４∶１流份（１．３３６）和活性单体（１．３５８）稍弱于呋噻米（１．４１１），而接近氢氯噻嗪（１．３７０）。从利尿急缓度（１ ｈ尿量/７ ｈ尿量）看，３０∶１流份（０．５２７）、４∶１流份（０．５２０）和活性单体（０．５２８）利尿作用速度介于快速利尿药呋噻米（０．６６６）与氢氯噻嗪（０．４７７）之间。
利尿物质结构鉴定：白色粉末，易溶于乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮，不易溶于石油醚，ｍｐ：２８５～２９１ ℃。ＥＩ－ＭＳ ｍ/ｚ：４５６ （Ｍ＋），４３８［Ｍ－Ｈ２Ｏ］＋，４２３，４１０，３９５，
３0０，２４８，２３３，２１９，２０３，１８９，１７５，１６３，１４７，１３３，１１９，１０５，
９５，８１，６９，５７；１Ｈ－ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ，Ｃ５Ｄ５Ｎ） δ：５．４８（１Ｈ，ｓ），３．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ），２．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１ Ｈｚ），２．１０（１Ｈ，ｍ），２．３０ （１Ｈ，ｍ），１．８２－２．００（７Ｈ，ｍ），１．３０－１．６４（９Ｈ，ｍ），１．１１－１．２７（７Ｈ，ｍ），０．９３－１．０８（１４Ｈ，ｍ），０．８０－０．８７ （４Ｈ，ｍ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，Ｃ５Ｄ５Ｎ）δ：１７９．９，１３９．３，１２５．７，７８．１，５５．８，５３．６，４８．１，４８．１，４２．５，４０．０，３９．５，
３９．５，３９．４，３９．１，３７．５，３７．３，３３．６，３１．１，２８．８，２８．７，２８．２，
２４．９，２３．９，２３．６，２１．４，１８．８，１７．６，１７．５，１６．６，１５．７。综合ＥＳＩ－ＭＳ 、１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ数据进行解谱，并与文献波谱数据［９］对比（文献测定条件为：ＣＤＣｌ３，６００及１５０ ＭＨｚ），碳谱和氢谱数据吻合，鉴定为熊果酸（Ｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ，Ｃ３０Ｈ４８Ｏ３），结构式见图１。
３ 小结与讨论
首次证明枇杷果乙醇提取物的乙酸乙酯萃取段具有明显利尿作用，与氢氯噻嗪接近，虽然弱于强效利尿药呋噻米，但枇杷果药食两用，其提取物用作缓和利尿剂，长期使用，安全性有保障。
进一步通过活性跟踪法从乙酸乙酯利尿活性部位中追踪得到活性利尿单体熊果酸，揭示了枇杷果利尿作用的物质基础。利尿活性物质部位及活性单体的获得，为枇杷果开发为利尿药及制定关于该药理作用方面的药材质量标准研究奠定了基础。
由表１中可见，随着追踪过程的进行（乙酸乙酯部位→氯仿∶甲醇３０∶１流份→石油醚∶乙酸乙酯４∶１流份→有效单体），其利尿活性物质含量不断提高，但并没有观察到利尿活性按正比例关系提高，其原因有待进一步研究。
本研究用动物体内药理指标（代谢笼法）筛选成分，采取“前期小批量全面摸索，摸清有效物质部位（或流份）后，后期大批量重点制备分离”的活性跟踪策略，克服了活性跟踪中分离纯化所得样品量难以满足给药剂量的矛盾，同时节约了分离成本，加快了跟踪进程。本研究直接利用动物体内试验筛选得到活性成分，在活性成分筛选领域是为数不多的成功案例之一。
教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献：
［１］ 沙 娜，梁敬钰．枇杷叶研究进展［Ｊ］．海峡药学，２００６，１８（１）：６－１０．
［２］ ＬＩＮ Ｓ Ｑ，ＳＨＡＲＰＥ Ｒ Ｈ， ＪＡＮＩＣＫ Ｊ． Ｌｏｑｕａｔ： ｂｏｔａｎｙ ａｎｄ ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｈｏｒｔ Ｒｅｖ，１９９９，２３：２３３－２７６．
［３］ 张 玉，王建清．枇杷的营养成分及功能成分的研究进展［Ｊ］．食品科学，２００５，２６（９）：６０２－６０４．
［４］ 赵 静．枇杷核苦杏仁苷提取、纯化及其抗氧化活性研究［Ｄ］．南京：南京农业大学，２０１０．
［５］ 葛金芳．枇杷叶三萜酸的抗炎免疫作用及对慢性支气管炎的治疗作用与机制研究［Ｄ］．合肥：安徽医科大学，２００４．
［６］ 李 婷，林文津，徐榕青，等．枇杷叶的化学成分和药理作用研究进展［Ｊ］．中国野生植物资源，２０１０，２９（５）：１１－１４．
［７］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草．第４卷［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９９９．
［８］ ＡＢＤＡＬＡ Ｓ，ＭＡＲＴ?魱Ｎ－ＨＥＲＲＥＲＡ Ｄ，ＢＥＮＪＵＭＥＡ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｕｒｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｓｍｉｌａｘ ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１２，１４０（２）： ２７７－２８１．
［９］ ＳＥＥＢＡＣＨＥＲ Ｗ，ＳＩＭＩＣ Ｎ，ＷＥＩＳ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ １Ｈ ａｎｄ １３Ｃ ＮＭＲ ｒｅｓｏｎａｎｃｅｓ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， １８ａ－ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ １１－ｏｘｏ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ［Ｊ］．Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｃｈｅｍ，２００３，４１（８）：６３６－６３８．