曲宁淤QU Ning曰吴文惠于WU Wen-hui
（淤上海海洋大学食品学院，上海201306；于上海海洋大学海洋科学研究院，上海201306）
摘要院探讨不同处理方式海马蛋白的差异,并对其部分生化特性进行研究。利用硫酸铵分步沉淀、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDSPAGE)、bandscan 软件、红外图谱对蒸馏水复水，醋酸铵复水，烘烤炮制获得的海马蛋白质进行比较分析。结果发现，烘烤炮制的海马蛋白质结构被破坏，凝胶图谱无条带，而不同复水方法凝胶图谱具有显著差异；通过计算分子量得知海马中蛋白质主要为肌肉蛋白质中的肌浆蛋白与肌原纤维蛋白；对海马蛋白质的红外指纹图谱进行分析，海马不同处理方式提纯后的蛋白质与烘烤炮制的海马全蛋白质的图谱存在区别。
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关键词 院海马；蛋白质；提取分离；SDS-PAGE
中图分类号院R283 文献标识码院A 文章编号院1006-4311（2015）27-0163-06
0 引言
海马是一种经济价值较高的名贵中药，具有强身健体、补肾壮阳、舒筋活络、消炎止痛、镇静安神、止咳平喘等药用功能，现代药理学研究证明，海马具有镇静作用、激素样作用、抗肿瘤作用、抗炎作用、抗血栓作用、抗衰老作用、抗疲劳作用、以及增强学习记忆功能等。近期试验发现分离自海马的蛋白质能特异性结合于中枢神经膜蛋白，抑制氯离子通道的开启，对受体激动剂有拮抗作用。因此分离自海马的功能蛋白有可能成为镇静催眠的新型蛋白类药物。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验原料成年三斑海马（Hippocampustrimaculatus Leach），由中渔（福建）海洋生物科技有限公司提供。
1.1.2 实验试剂SDS-PAGE 相对分子质量（10kDa-170kDa）标准蛋白，购买于上海威奥生物科技有限公司；电泳所用试剂：30%丙烯酰胺（Acr）、10%SDS（十二烷基磺酸钠）、1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液；pH8.8、1.0mol/L Tris-HCl缓冲液；pH6.8、10%过硫酸铵；TEMED（四甲基乙二胺）；浓缩电极缓冲液为15.1gTris、94g 甘氨酸、5g SDS，用水溶解至1000mL；染色液为0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的乙醇，10%的冰醋酸；脱色液为10%的乙醇，10%的冰醋酸等其他其他分析纯化学试剂。
1.1.3 实验仪器电热鼓风干燥箱DHG-9070A；组织捣碎机（EJ 200-S）；聚丙烯酰胺垂直电泳装（Bio-Rad）；冷冻干燥机（Virtis 2K）；电泳凝胶成像分析系统；真空干燥箱DZF- 6020；PHS-3C 型精密PH 计；磁力加热恒温搅拌器；DYCZ-24D 双垂直电泳槽；电子精密天平AB204-N；高速冷冻离心机（Beckman）；恒温水浴锅（Memmert）HH.S11-2-S；摇床TS-3D ORBITAL SHAKER；DYY-2C 型电泳仪；傅立叶红外光谱仪；压片机。
1.2 方法
1.2.1 前期处理
1.2.1.1 蒸馏水复水方法取四匹干燥的海马，将表面清洗干净，称重，放入100ml 蒸馏水中，置于37益恒温水浴箱中复水12h。海马吸水涨润，表面饱满，弹性增加。
1.2.1.2 醋酸铵复水方法取四匹干燥的海马，表面清洗干净，称重，放入100ml0.5mol/L 的醋酸铵溶液中，置于37益恒温水浴箱中复水12h。海马吸水涨润，表面饱满，弹性增加。
1.2.1.3 烘烤法炮制将海马表面清洗干净，放置于电热保温干燥箱中，将温度上升到100益，恒温30 分钟，至表面呈微黄褐色，躯体鼓起，取出微凉碾成细末。
1.2.2 海马蛋白提取分离方法将浸泡后的海马取出，沥干水分，用小刀将海马皮小心剥离，剥离得到的肌肉沥干水分后称重，得到海马肌肉将得到的肌肉剪碎，用研钵再进一步研碎，置于干净的小烧杯中，加重量约其10 倍的磷酸盐缓冲液（pH7.4，0.1mol/L），之后用均质机均质，然后进行匀浆，10000rpm 匀浆10s，持续两次，15000rpm 匀浆10s，持续两次。所得浆状物在5000rpm 条件下离心10min，取上清液分三部分处理。取1.5ml 上清液置于2ml 离心管中保存，三份，此为样品1；取20ml 上清液进行冷冻干燥，得到粉末，此为样品2；剩余的上清液在20益下加（NH4）2SO4 至饱和度40%，静置10min，5000rpm 离心10min 得到沉淀，此为样品3；在上清液中继续加（NH4）2SO4 至饱和度60%，静置10min，5000rpm 离心10min 得到沉淀为样品4；往上述上清液中继续加（NH4）2SO4 至饱和度80%，静置10min，5000rpm 离心10min，得到沉淀（样品5）和上清液（样品6）。将蒸馏水复水后取得样品标记为A1，A2,……A6，醋酸铵溶液复水后取得样品标记为B1，B2……B6。
1.2.3 海马蛋白的SDS-PAGE 方法
按照上述要求将浓缩胶与分离胶配置后，将醋酸铵复水，蒸馏水复水处理后的海马样品经硫酸铵分步沉淀中所得到的粉末和沉淀（样品A2-A6,B2-B6）分别取10mg 和30mg 溶于1ml 的PBS 溶液（pH7.4,0.1mol/L）中，超声后离心取上清液，然后进行SDS-PAGE 电泳。取20g 经炮制后研碎的海马粉末，溶于100mlPBS 溶液（pH7.4,0.1mol/L）中，超声溶解20min，离心后取上清液（样品C），进行SDSPAGE电泳。取出平板中的凝胶立即浸泡于固定液中固定1h，再将固定好凝胶置于的45益染色液中浸泡15-30min，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一遍，最后多次交换脱色液，直至凝胶上的背景脱净为止。将凝胶放入电泳凝胶成像分析系统中成像并分析。
1.2.4 红外光谱蒸馏水，醋酸铵复水后，由磷酸盐缓冲液提取后所得上清液，冷冻干燥得到的冻干粉（样品A2，B2）以及烘烤炮制的海马粉末样品（样品C），各取约2mg 研磨，然后分别与100耀200mg 干燥溴化钾粉末充分混合，并再次用球磨机研磨1耀2min，转入合适的模具中，使之分布均匀，抽空下压成透明薄片装入压片夹，以溴化钾空白压片作参比，扫描红外光谱。
2 结果与分析
2.1 海马复水后效果经蒸馏水复水后的海马与醋酸铵复水后的相比，醋酸铵复水的海马相对较软，弹性更强，在去皮剔骨过程中肌肉更容易脱落，因此提取出蛋白质总量更高，肌肉提取率更高。
2.2 海马蛋白质的SDS-PAGE
对得到的凝胶电泳图片进行分析，发现使用蒸馏水复水与硫酸铵复水的蛋白质条带清晰，而烘烤泡制后的海马中无任何蛋白质条带，分析海马中的蛋白质可能被高温破坏。
蛋白质分步沉淀效果如下：
2.2.1 蒸馏水复水蒸馏水复水的海马，经硫酸铵分步沉淀得到的海马蛋白的SDS-PAGE 如图1。根据各条色带与染料的迁移距离计算相对迁移率Rm，以标准蛋白的IgMr 对相对迁移率Rm 作图，经线性回归得回归方程
logMR=-0.9998Rm+2.2633；R2=0.9674
标准分子量蛋白的标准曲线见图2：根据标准分子量蛋白的标准曲线，同时测定SDS-PAGE 凝胶上的迁移距离，计算出Rm 值，得到海马蛋白质分子量。
经过不同浓度的硫酸铵分离沉淀后，海马蛋白质的SDS-PAGE 图谱具有显著差异，当硫酸铵浓度达到60%，沉淀中的蛋白质含量骤减。如图1 所示，海马水溶性蛋白的上清液冻干粉中，SDS-PAGE 图谱具有蛋白质浓度高、基本呈连续分布的特征。这是由于肌肉组织中存在多种分子量的蛋白质，所以电泳图谱呈现蛋白质浓度高和基本连续分布的特征。蒸馏水复水后的海马蛋白组成主要由9 种蛋白质组成，其相对分子量分别为104.4kDa、78kDa、68.1kDa、57.1kDa、50.2kDa、46kDa、35kDa、31.5kDa 和20.6kDa。其中68.1kDa 的蛋白带为强带型，附近有大量蛋白质连续条带。
一定的浓度范围内样品电泳中条带的深浅和样品浓度之间存在着线性关系，在上样体积一定的情况下，含量越高条带颜色越深。用扫描仪扫描电泳实验所得的凝胶，将所得用扫描仪扫描电泳实验所得的凝胶，将所得到的凝胶图像利用Bandscan 软件分析其条带的灰度值。利用bandscan的灰度软件对每个条带里的蛋白质种类的所占整个条带的含量进行粗略计算，结果表3 所示。
表3 显示，当硫酸铵浓度达到40%，沉淀中含有分子量为104.4kDa，68.1kDa，57.1kDa，50.2kDa，46kDa，35kDa的蛋白质；当硫酸铵浓度60豫时，沉淀中含有分子量为68.1kDa，57.1kDa，50.2kDa，46kDa 的蛋白质；当硫酸铵浓度达到80%，沉淀中的蛋白质主要是2 种蛋白质，分子量为57.1kDa，50.2kDa，其相对含量分别是66.9%、33.1%。观察发现，在硫酸铵浓度为40豫，分子量为104.4kDa，78kDa，35kDa 蛋白质全部沉淀下来，沉淀中含量最高的蛋白质为分子量50kDa 与46kDa 的蛋白质。而分子量为68.1kDa，46kDa 的蛋白质需要硫酸铵浓度达到60豫才能沉淀完全。当硫酸铵浓度达到80豫，50kDa 与46kDa 的蛋白质依然存在于沉淀中。
2.2.2 醋酸铵复水醋酸铵复水的海马，经硫酸铵分步沉淀得到的海马蛋白的SDS-PAGE 如图3。以标准蛋白的IgMr 对相对迁移率Rm 作图, 经线性回归得回归方程，如图4。
经醋酸铵溶液处理过后的海马蛋白组成主要由10 种蛋白质组成，经蒸馏水复水后的分子量也基本类似，分子量分布为17.5KDa，21.4KDa，37.3KDa，48KDa，53KDa，59.6KDa，69KDa，96.3KDa，112KDa，198KDa 分子量附近的蛋白质，和蒸馏水浸泡的海马相比，出现了分子量17.5KDa 附近放入小分子蛋白质与分子量在198KDa 附近的大分子蛋白质。在B5 样品中，蛋白质条带更多，浓度更高，连续性更强。分子量在48KDa 附近的蛋白质是强分子带。
利用bandscan对SDS-PAGE 凝胶电泳进行分析，得到各蛋白质分别在样品B2，B3，B4，B5中所占含量，如表4所示。
醋酸铵复水的海马蛋白质中，含量最高的是分子量在53KDa 与48KDa 附近的蛋白质。当硫酸铵浓度为40豫时，分子量198KDa，112KDa，96.3KDa，69KDa，附近的蛋白质已经完全沉淀下来。当硫酸铵浓度达到60豫时，分子量为48KDa 的蛋白质沉淀完全。对硫酸铵浓度80%沉淀后的上清液进行SDS-PAGE,发现其中几乎不含蛋白质，说明在硫酸铵浓度80豫的时候，分子量在59.6KDa，53KDa 附近的蛋白质沉淀完全。
2.3 海马蛋白质红外指纹图谱特征
蛋白质有许多仲酰胺基团，他们的有关特征谱峰彼此重叠，所以必然在3300cm-1、3060cm-1、1650cm-1、1550cm-1、1290cm-1 附近出现很特征的谱带。而两端的-NH2与-COOH 的谱带则随着多肽与蛋白质的相对分子质量的增大而越来越不明显，甚至看不到。
将烘烤炮制方法得到的海马全蛋白成分进行红外溴化钾压片法，得到海马蛋白质红外指纹图谱如图5 所示。
红外光谱的特征吸收峰是3352cm-1，2950cm-1，1660cm -1，1545cm -1，1462cm -1，1270cm -1，1243cm -1，1120cm-1，1067cm-1，614cm-1，568cm-1。3352cm-1 附近是伯酰胺氢键NH 的酰胺A 带NH 伸缩振动，1660cm-1 附近是酰胺玉带的C=O 伸缩振动，1462cm-1 为CH2或CH3 弯曲振动，1270cm-1 附近为仲酰胺的酰胺芋谱带的HNH 的变形振动，1243cm-1 附近为酰胺芋谱带的CNC 振动或CO 伸缩振动。614cm-1 附近是仲酰胺的酰胺郁带。
海马水溶性蛋白质样品A2，按照溴化钾压片法得到的海马蛋白质红外指纹图谱如图6。
红外光谱的特征吸收峰是3457cm-1，3370cm-1，3140cm-1，2900cm-1，2450cm-1，1721cm-1，1646cm-1，1272cm-1，1150cm-1，1074cm-1，980cm-1，952cm-1，880cm-1，800cm-1，600cm-1，530cm-1，3457cm-1 是仲酰胺游离的反式N-H 伸缩振动和-OH 振动，3370cm-1 附近是酰胺NH 伸缩振动，3140cm-1 是仲酰胺顺式氢键中的N-H 的伸缩振动，2900cm-1 附近的甲基和亚甲基的吸收峰，1721cm-1附近是环状酰胺酌-内酰胺的酰胺玉带的C=O 伸缩振动，1646cm-1 附近是酰胺玉带的C=O 伸缩振动，1272cm-1附近为酰胺芋谱带的HNH 的变形振动。600cm-1 附近是仲酰胺的酰胺郁带。
将不同炮制方法获得的水溶性蛋白质和全蛋白红外图谱归入图7。
全蛋白（绿色曲线）3352cm-1 附近的伯酰胺氢键NH的酰胺A 带NH 伸缩振动吸收峰，从全蛋白分离的水溶性蛋白质，在3457cm-1 附近的仲酰胺游离反式N-H 伸缩振动和3140cm-1 附件的仲酰胺顺式氢键中的N-H 伸缩振动被显现出来，同时伯酰胺氢键NH 的酰胺A 带NH 伸缩振动蓝移到3370cm-1 附近。全蛋白（绿色曲线）被纯化成水溶性蛋白后，2900cm-1 和2950cm-1 附近的甲基和亚甲基的吸收峰数量显著减少，说明伴随全蛋白的其他物质如甾醇、生物碱、萜类等水不溶性化合物被分离。特别是分离的水溶性蛋白质在2450cm-1 有强烈的吸收峰，暗示着我们提取过程所使用的磷酸盐缓冲液残存在蛋白质中。全蛋白（绿色曲线）1660cm-1 附近的酰胺玉带的C=O 伸缩振动，经纯化后，羧基或酮基的C=O 伸缩振动1721cm-1被呈现出来。全蛋白（绿色曲线）被纯化成水溶性蛋白后，1545cm-1 和1642cm-1 附近的甲基和亚甲基的振动吸收峰完全消失，同样可以说明伴随全蛋白的其他物质如甾醇、生物碱、萜类等水不溶性化合物被分离。
被纯化后的水溶性蛋白在1270cm-1 处的附近为仲酰胺的酰胺芋谱带的HNH 的变形振动吸收峰值明显增加，纯化后水溶性蛋白，在1150cm-1，1074cm-1 的吸收峰数量明显增多，且980cm-1，952cm-1，880cm-1，800cm-1处的-NH2，-NH 的弯曲振动被显现出来。
海马不同炮制方法获得的水溶性蛋白质的IR 指纹图显示为黑线（蒸馏水复水海马蛋白冻干粉）、绿色（醋酸铵复水海马蛋白冻干粉）。2 种处理方法在酰胺N-H 伸缩振动没有差别，在酰胺芋（1290cm-1）郁（620cm-1 及600cm-1）、吁（720cm-1）、遇（1420-1400cm-1）也没有随处理方式不同显示出差别。但是在羰基1721cm-1 吸收峰和酰胺的C=O 的玉带1646cm-1 吸收峰上出现显著不同，羰基1721cm-1 吸收峰和酰胺的C=O 的玉带1646cm-1 吸收峰能作为鉴别不同处理方式的参考指标之一。
2.4 海马蛋白质种类分析
海马蛋白质中，分布着分子量为20KDa，30KDa，35KDa，37KDa，46KDa，48KDa，53KDa，58KDa，68KDa，78KDa，96KDa，104KDa 及198KDa，查资料发现，肌浆蛋白中代谢功能的酶，磷酸化酶（PR），丙酮酸激酶（PK），烯醇酶（ENO），肌酸激酶亚基（CK），醛羧酶（ALD），磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），分子量分别约为97kDa，58kDa，48kDa，43kD，40kDa 和35kDa。肌原纤维蛋白（MFP）中的肌球蛋白重链（myosin heavy chain），肌动蛋白（actin），原肌球蛋白（tropomyosin，Tm）分子量分别约200kDa、45kDa 和37kDa。对比发现，本实验中海马蛋白质分子量均接近与这些数据，可初步判定，海马中蛋白质主要为肌肉蛋白质中的肌浆蛋白与肌原纤维蛋白。海马蛋白质中，分子量为68kDa附近的蛋白质含量很高，但此种蛋白具体为起到什么作用，还并不清楚。
3 讨论
用蒸馏水与乙酸铵对海马进行泡制后，乙酸铵泡制后的海马去皮剔骨更容易，得到的肌肉组织相对更多，这也是SDS-PAGE 电泳中条带颜色更深，含量更高的原因。使用乙酸铵泡制海马，肌肉回收率更高，由于乙酸铵水溶液pH 为中性，也不会对海马中的蛋白产生破坏，因此在处理海马时可以选择尝试醋酸铵泡制。高温炮制的海马蛋白质几乎全被破坏，若要分离海马中的蛋白质，不能采用此种方法。
利用凝胶图谱分析软件bandscan，通过检测SDSPAGE凝胶图谱的灰度初步测定海马中各类蛋白质的含量，观察发现，经蒸馏水复水的海马，在硫酸铵浓度为40豫，分子量为78kDa，104.4kDa，35kDa 蛋白质全部沉淀下来。而分子量为68.1kDa，46kDa 的蛋白质需要硫酸铵浓度达到60豫才能沉淀完全。由此图推测，分子量为31.5kDa 与20.6kDa 的小分子量蛋白质分布在离心后的上清液中。而用醋酸铵腹水的海马，当硫酸铵浓度为40豫时，分子量198KDa，112KDa，96.3KDa，69KDa，附近的蛋白质已经完全沉淀下来。当硫酸铵浓度达到60豫时，分子量为48KDa 的蛋白质沉淀完全。对硫酸铵浓度80%沉淀后的上清液进行SDS-PAGE,发现其中几乎不含蛋白质，说明在硫酸铵浓度80豫的时候，分子量在59.6KDa，53KDa 附近的蛋白质沉淀完全。
综合蒸馏水泡制与乙酸铵泡制的海马SDS-PAGE图，海马蛋白质中，分布着分子量为20KDa，30KDa，35KDa，37KDa，46KDa，48KDa，53KDa，58KDa，68KDa，78KDa，96KDa，104KDa 及198KDa，可初步判定，海马中蛋白质主要为肌肉蛋白质中的肌浆蛋白与肌原纤维蛋白。通过蒸馏水复水的海马蛋白质，蛋白质的含量分别为68.1kDa>20.6kDa>50.2kDa>78kDa>57.1kDa>104.4kDa>31.5kDa>35kDa。通过硫酸铵复水的蛋白质含量48kDa>53kDa>69kDa>59.6kDa>198kDa>17.5kDa>21.4kDa>112kDa>37.4kDa。对比发现，不同复水方法得到的蛋白质的种类及含量具有显著差异。
对海马蛋白质的红外指纹图谱进行分析，发现海马提纯后的蛋白质与全蛋白质的图谱存在一定区别，两份图谱中都分布着许多仲酰胺基团的特征峰，由于提纯后蛋白质浓度高，因此蛋白质的特征峰，酰胺基团的酰胺玉谱带与酰胺域谱带吸收峰值明显增加。而甲基和亚甲基的吸收峰数量显著减少，说明伴随全蛋白的其他物质如甾醇、生物碱、萜类等水不溶性化合物被分离。海马不同炮制方法获得的水溶性蛋白质的IR 指纹图仅在羰基1721cm-1 吸收峰和酰胺的C=O 的玉带1646cm-1 吸收峰上出现显著不同，羰基1721cm-1 吸收峰和酰胺的C=O 的玉带1646cm-1 吸收峰能作为鉴别不同处理方式的参考指标之一。
